એન્થેલ્મિન્ટિક દવા N,N-ડાયેથાઇલ-એમ-ટોલુઆમાઇડ (ડીઈઈટી) એ AChE (એસિટિલકોલાઇનસ્ટેરેઝ) ને અવરોધે છે અને અતિશય વેસ્ક્યુલરાઇઝેશનને કારણે સંભવિત કાર્સિનોજેનિક ગુણધર્મો ધરાવે છે. આ પેપરમાં, અમે બતાવીએ છીએ કે DEET ખાસ કરીને એન્ડોથેલિયલ કોષોને ઉત્તેજિત કરે છે જે એન્જીયોજેનેસિસને પ્રોત્સાહન આપે છે, જેનાથી ગાંઠની વૃદ્ધિમાં વધારો થાય છે. DEET સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓને સક્રિય કરે છે જે એન્જીયોજેનેસિસ તરફ દોરી જાય છે, જેમાં પ્રસાર, સ્થળાંતર અને સંલગ્નતાનો સમાવેશ થાય છે. આ એન્ડોથેલિયલ કોષોમાં NO ઉત્પાદન અને VEGF અભિવ્યક્તિમાં વધારો સાથે સંકળાયેલ છે. M3 ને શાંત કરવા અથવા ફાર્માકોલોજિકલ M3 અવરોધકોનો ઉપયોગ કરવાથી આ બધી અસરો નાબૂદ થાય છે, જે સૂચવે છે કે DEET-પ્રેરિત એન્જીયોજેનેસિસ M3-સંવેદનશીલ છે. એન્ડોથેલિયલ અને HEK કોષોમાં કેલ્શિયમ સિગ્નલિંગને સંડોવતા પ્રયોગો જે M3 રીસેપ્ટર્સને વધુ પડતા વ્યક્ત કરે છે, તેમજ બંધનકર્તા અને ડોકીંગ અભ્યાસો સૂચવે છે કે DEET M3 રીસેપ્ટર્સના એલોસ્ટેરિક મોડ્યુલેટર તરીકે કાર્ય કરે છે. વધુમાં, DEET AChE ને અટકાવે છે, જેનાથી એસિટિલકોલાઇનની જૈવઉપલબ્ધતા અને M3 રીસેપ્ટર્સ સાથે તેનું બંધન વધે છે, અને એલોસ્ટેરિક નિયમન દ્વારા પ્રોએન્જિયોજેનિક અસરોમાં વધારો થાય છે.
પ્રાથમિક ECs ને સ્વિસ ઉંદરોના મહાધમનીમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ કોબાયાશી પ્રોટોકોલ 26 માંથી અપનાવવામાં આવી હતી. મુરિન ECs ને EBM-2 માધ્યમમાં 5% ગરમી-નિષ્ક્રિય FBS સાથે ચોથા પેસેજ સુધી સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.
HUVEC, U87MG, અથવા BF16F10 ના પ્રસાર પર DEET ની બે સાંદ્રતાની અસરનું વિશ્લેષણ CyQUANT સેલ પ્રોલિફરેશન એસે કીટ (મોલેક્યુલર પ્રોબ્સ, C7026) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, પ્રતિ કૂવામાં 5.103 કોષોને 96-કુવા પ્લેટમાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા, રાતોરાત જોડવા દેવામાં આવ્યા હતા, અને પછી 24 કલાક માટે DEET સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. વૃદ્ધિ માધ્યમ દૂર કર્યા પછી, માઇક્રોપ્લેટના દરેક કૂવામાં ડાઇ બંધનકર્તા દ્રાવણ ઉમેરો અને કોષોને 37 °C પર 30 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો. 485 nm ઉત્તેજના ફિલ્ટર્સ અને 530 nm ઉત્સર્જન ફિલ્ટર્સથી સજ્જ મિથ્રાસ LB940 મલ્ટિમોડ માઇક્રોપ્લેટ રીડર (બર્થોલ્ડ ટેક્નોલોજીસ, બેડ વાઇલ્ડબેડ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ સ્તર નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.
HUVEC ને 96-કુવા પ્લેટોમાં દરેક કૂવામાં 104 કોષોની ઘનતા પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા. કોષોને 24 કલાક માટે DEET સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. કોષ સધ્ધરતાનું મૂલ્યાંકન કલરમેટ્રિક MTT એસે (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, M5655) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. 570 nm ની તરંગલંબાઇ પર મલ્ટિમોડ માઇક્રોપ્લેટ રીડર (મિથ્રાસ LB940) પર ઓપ્ટિકલ ઘનતા મૂલ્યો મેળવવામાં આવ્યા હતા.
ઇન વિટ્રો એન્જીયોજેનેસિસ એસેનો ઉપયોગ કરીને DEET ની અસરોનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો. 10-8 M અથવા 10-5 M DEET સાથેની સારવારથી HUVECs માં રુધિરકેશિકા લંબાઈની રચનામાં વધારો થયો (આકૃતિ 1a, b, સફેદ પટ્ટાઓ). નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, 10-14 થી 10-5 M સુધીની DEET સાંદ્રતા સાથેની સારવાર દર્શાવે છે કે રુધિરકેશિકા લંબાઈ 10-8 M DEET પર એક ઉચ્ચપ્રદેશ સુધી પહોંચી ગઈ છે (પૂરક આકૃતિ S2). 10-8 M અને 10-5 M ની સાંદ્રતા શ્રેણીમાં DEET સાથે સારવાર કરાયેલ HUVECs ની ઇન વિટ્રો પ્રોએન્જિયોજેનિક અસરમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી.
નિયોવાસ્ક્યુલરાઇઝેશન પર DEET ની અસર નક્કી કરવા માટે, અમે ઇન વિવો નિયોવાસ્ક્યુલરાઇઝેશન અભ્યાસો કર્યા. 14 દિવસ પછી, 10-8 M અથવા 10-5 M DEET સાથે પ્રીકલ્ચર કરેલા એન્ડોથેલિયલ કોષો સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલા ઉંદરોમાં હિમોગ્લોબિન સામગ્રીમાં નોંધપાત્ર વધારો જોવા મળ્યો (આકૃતિ 1c, સફેદ પટ્ટાઓ).
વધુમાં, DEET-પ્રેરિત નિયોવાસ્ક્યુલરાઇઝેશનનો અભ્યાસ U87MG ઝેનોગ્રાફ્ટ-બેરિંગ ઉંદરોમાં કરવામાં આવ્યો હતો જેમને DEET સાથે દરરોજ (ip) 10-5 M ની પ્લાઝ્મા સાંદ્રતા પ્રેરિત કરવા માટે જાણીતી માત્રામાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવતું હતું, જે ખુલ્લા માનવોમાં સામાન્ય છે. 23 માં. U87MG કોષોને ઉંદરમાં ઇન્જેક્ટ કર્યાના 14 દિવસ પછી શોધી શકાય તેવા ગાંઠો (એટલે કે ગાંઠો >100 mm3) જોવા મળ્યા. 28મા દિવસે, DEET-સારવાર કરાયેલ ઉંદરોમાં નિયંત્રણ ઉંદરોની તુલનામાં ગાંઠની વૃદ્ધિ નોંધપાત્ર રીતે વધી હતી (આકૃતિ 1d, ચોરસ). વધુમાં, ગાંઠોના CD31 સ્ટેનિંગ દર્શાવે છે કે DEET એ રુધિરકેશિકા ક્ષેત્રમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો છે પરંતુ માઇક્રોવેસલ ઘનતામાં વધારો કર્યો નથી. (આકૃતિ 1e-g).
DETA-પ્રેરિત પ્રસારમાં મસ્કરીનિક રીસેપ્ટર્સની ભૂમિકા નક્કી કરવા માટે, pFHHSiD (10-7 M, એક પસંદગીયુક્ત M3 રીસેપ્ટર વિરોધી) ની હાજરીમાં 10-8 M અથવા 10-5 M DETA નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. HUVEC ની સારવાર. pFHHSiD એ બધી સાંદ્રતા પર DETA ના પ્રસાર ગુણધર્મોને સંપૂર્ણપણે અવરોધિત કર્યા (કોષ્ટક 1).
આ પરિસ્થિતિઓમાં, અમે એ પણ તપાસ્યું કે શું DEET HUVEC કોષોમાં રુધિરકેશિકાઓની લંબાઈ વધારશે. તેવી જ રીતે, pFHHSiD એ DEET-પ્રેરિત રુધિરકેશિકાઓની લંબાઈને નોંધપાત્ર રીતે અટકાવી (આકૃતિ 1a, b, ગ્રે બાર). વધુમાં, M3 siRNA સાથે સમાન પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા. જોકે નિયંત્રણ siRNA રુધિરકેશિકાઓની રચનાને પ્રોત્સાહન આપવામાં અસરકારક નહોતું, M3 મસ્કરીનિક રીસેપ્ટરને શાંત કરવાથી રુધિરકેશિકાઓની લંબાઈ વધારવાની DEET ની ક્ષમતા નાબૂદ થઈ ગઈ (આકૃતિ 1a, b, કાળા બાર).
વધુમાં, 10-8 M અથવા 10-5 M DEET-પ્રેરિત વેસ્ક્યુલરાઇઝેશન ઇન વિટ્રો અને નિયોવાસ્ક્યુલરાઇઝેશન ઇન વિવો બંને pFHHSiD દ્વારા સંપૂર્ણપણે અવરોધિત હતા (આકૃતિ 1c, d, વર્તુળો). આ પરિણામો સૂચવે છે કે DEET પસંદગીયુક્ત M3 રીસેપ્ટર વિરોધી અથવા M3 siRNA પ્રત્યે સંવેદનશીલ માર્ગ દ્વારા એન્જીયોજેનેસિસને પ્રોત્સાહન આપે છે.
AChE એ DEET નું મોલેક્યુલર લક્ષ્ય છે. ડોનેપેઝિલ જેવી દવાઓ, જે AChE અવરોધકો તરીકે કાર્ય કરે છે, ઇન વિટ્રો અને માઉસ હિન્ડલિમ્બ ઇસ્કેમિયા મોડેલ્સમાં EC એન્જીયોજેનેસિસને ઉત્તેજિત કરી શકે છે14. અમે HUVEC માં AChE એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ પર DEET ની બે સાંદ્રતાની અસરનું પરીક્ષણ કર્યું. નિયંત્રણ પરિસ્થિતિઓની તુલનામાં DEET ની ઓછી (10-8 M) અને ઉચ્ચ (10-5 M) સાંદ્રતાએ એન્ડોથેલિયલ AChE પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો કર્યો (આકૃતિ 2).
DEET (10-8 M અને 10-5 M) ની બંને સાંદ્રતાએ HUVEC પર એસિટિલકોલિનેસ્ટેરેઝ પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો કર્યો. BW284c51 (10-5 M) નો ઉપયોગ એસિટિલકોલિનેસ્ટેરેઝ અવરોધકો માટે નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. પરિણામો વાહન-સારવાર કરાયેલ કોષોની તુલનામાં DEET ની બે સાંદ્રતા સાથે સારવાર કરાયેલ HUVEC પર AChE પ્રવૃત્તિના ટકાવારી તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. મૂલ્યો છ સ્વતંત્ર પ્રયોગોના સરેરાશ ± SEM તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. *p < 0.05 નિયંત્રણની તુલનામાં (ક્રુસ્કલ-વોલિસ અને ડન બહુવિધ તુલના પરીક્ષણ).
નાઈટ્રિક ઑકસાઈડ (NO) એ એન્જીયોજેનિક પ્રક્રિયા 33 માં સામેલ છે, તેથી, DEET-ઉત્તેજિત HUVECs માં NO ઉત્પાદનનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો. નિયંત્રણ કોષોની તુલનામાં DEET-સારવાર કરાયેલ એન્ડોથેલિયલ NO ઉત્પાદનમાં વધારો થયો હતો, પરંતુ તે માત્ર 10-8 M (આકૃતિ 3c) ની માત્રા પર જ મહત્વપૂર્ણ બન્યું હતું. DEET-પ્રેરિત NO ઉત્પાદનને નિયંત્રિત કરતા પરમાણુ ફેરફારો નક્કી કરવા માટે, વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા eNOS અભિવ્યક્તિ અને સક્રિયકરણનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. જોકે DEET સારવારથી eNOS અભિવ્યક્તિમાં કોઈ ફેરફાર થયો ન હતો, તેણે eNOS ફોસ્ફોરાયલેશન (આકૃતિ 3d) માં સારવાર ન કરાયેલ કોષોની તુલનામાં તેના અવરોધક સ્થળ (Thr-495) ને ઘટાડીને તેની સક્રિય સાઇટ (Ser-1177) પર eNOS ફોસ્ફોરાયલેશનમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો હતો. વધુમાં, સક્રિયકરણ સાઇટ અને અવરોધક સ્થળ પર ફોસ્ફોરાયલેશન eNOS ના ગુણોત્તરની ગણતરી એન્ઝાઇમની કુલ માત્રામાં ફોસ્ફોરાયલેશન eNOS ની માત્રાને સામાન્ય બનાવ્યા પછી કરવામાં આવી હતી. સારવાર ન કરાયેલ કોષોની તુલનામાં DEET ની દરેક સાંદ્રતા સાથે સારવાર કરાયેલ HUVECs માં આ ગુણોત્તરમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો (આકૃતિ 3d).
અંતે, મુખ્ય પ્રોએન્જિયોજેનિક પરિબળોમાંના એક, VEGF ની અભિવ્યક્તિનું વિશ્લેષણ વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા કરવામાં આવ્યું. DEET એ VEGF અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો, જ્યારે pFHHSiD એ આ અભિવ્યક્તિને સંપૂર્ણપણે અવરોધિત કરી.
DEET ની અસરો M3 રીસેપ્ટર્સના ફાર્માકોલોજિકલ બ્લોકેડ અને ડાઉનરેગ્યુલેશન બંને પ્રત્યે સંવેદનશીલ હોવાથી, અમે એવી પૂર્વધારણાનું પરીક્ષણ કર્યું કે DEET કેલ્શિયમ સિગ્નલિંગને વધારી શકે છે. આશ્ચર્યજનક રીતે, DEET HUVEC (ડેટા બતાવેલ નથી) અને HEK/M3 (આકૃતિ 4a, b) માં ઉપયોગમાં લેવાતી બંને સાંદ્રતા માટે સાયટોપ્લાઝમિક કેલ્શિયમ વધારવામાં નિષ્ફળ ગયું.
પોસ્ટ સમય: ડિસેમ્બર-૩૦-૨૦૨૪