જથ્થાત્મક ગિબેરેલિન બાયોસેન્સર શૂટ એપિકલ મેરિસ્ટેમમાં ઇન્ટરનોડ સ્પષ્ટીકરણમાં ગિબેરેલિનની ભૂમિકા દર્શાવે છે.

થડની રચના માટે શૂટી ટોચના મેરિસ્ટેમ (SAM) ની વૃદ્ધિ મહત્વપૂર્ણ છે. છોડના હોર્મોન્સગિબેરેલિન્સ(GAs) છોડના વિકાસના સંકલનમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે, પરંતુ SAM માં તેમની ભૂમિકા હજુ સુધી સારી રીતે સમજી શકાઈ નથી. અહીં, અમે GA ઓળખ પર તેના અધોગતિને જાળવી રાખીને GA ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રતિભાવમાં તેના આવશ્યક નિયમનકારી કાર્યને દબાવવા માટે DELLA પ્રોટીનનું એન્જિનિયરિંગ કરીને GA સિગ્નલિંગનું રેશિયોમેટ્રિક બાયોસેન્સર વિકસાવ્યું છે. અમે દર્શાવ્યું છે કે આ અધોગતિ-આધારિત બાયોસેન્સર વિકાસ દરમિયાન GA સ્તરો અને સેલ્યુલર સેન્સિંગમાં ફેરફારોને સચોટ રીતે રેકોર્ડ કરે છે. અમે SAM માં GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિને મેપ કરવા માટે આ બાયોસેન્સરનો ઉપયોગ કર્યો હતો. અમે બતાવીએ છીએ કે ઉચ્ચ GA સિગ્નલો મુખ્યત્વે અંગ પ્રાઇમોર્ડિયા વચ્ચે સ્થિત કોષોમાં હાજર હોય છે, જે ઇન્ટરનોડ કોષોના પુરોગામી છે. ગેઇન- અને લોસ-ઓફ-ફંક્શન અભિગમોનો ઉપયોગ કરીને, અમે આગળ દર્શાવીએ છીએ કે GA કોષ વિભાજન વિમાનના દિશા નિર્દેશનને નિયંત્રિત કરે છે, ઇન્ટરનોડ્સના કેનોનિકલ સેલ્યુલર સંગઠનને સ્થાપિત કરે છે, જેનાથી SAM માં ઇન્ટરનોડ સ્પષ્ટીકરણને પ્રોત્સાહન મળે છે.
અંકુરની ટોચ પર સ્થિત અંકુરની ટોચની મેરીસ્ટેમ (SAM) માં સ્ટેમ કોષોનો એક વિશિષ્ટ ભાગ હોય છે જેની પ્રવૃત્તિ છોડના સમગ્ર જીવન દરમિયાન મોડ્યુલર અને પુનરાવર્તિત રીતે બાજુના અંગો અને સ્ટેમ ગાંઠો ઉત્પન્ન કરે છે. આ દરેક પુનરાવર્તિત એકમો, અથવા છોડના ગાંઠોમાં, ગાંઠો પર ઇન્ટરનોડ્સ અને બાજુના અંગો અને પાંદડાની ધરીમાં એક્સિલરી મેરીસ્ટેમનો સમાવેશ થાય છે. વિકાસ દરમિયાન છોડના ગાંઠોનો વિકાસ અને સંગઠન બદલાય છે. અરેબિડોપ્સિસમાં, વનસ્પતિ તબક્કા દરમિયાન ઇન્ટરનોડલ વૃદ્ધિ દબાવવામાં આવે છે, અને એક્સિલરી મેરીસ્ટેમ રોઝેટ પાંદડાઓની ધરીમાં નિષ્ક્રિય રહે છે. ફૂલોના તબક્કામાં સંક્રમણ દરમિયાન, SAM પુષ્પગુચ્છ મેરીસ્ટેમ બની જાય છે, જે વિસ્તરેલ ઇન્ટરનોડ્સ અને એક્સિલરી કળીઓ, કૌલિન પાંદડાઓની ધરીમાં શાખાઓ અને પછીથી, પાંદડા વિનાના ફૂલો ઉત્પન્ન કરે છે. જોકે આપણે પાંદડા, ફૂલો અને શાખાઓની શરૂઆતને નિયંત્રિત કરતી પદ્ધતિઓને સમજવામાં નોંધપાત્ર પ્રગતિ કરી છે, ઇન્ટરનોડ્સ કેવી રીતે ઉદ્ભવે છે તે વિશે પ્રમાણમાં ઓછું જાણીતું છે.
GA ના અવકાશી-તાપમાન વિતરણને સમજવાથી વિવિધ પેશીઓમાં અને વિવિધ વિકાસ તબક્કામાં આ હોર્મોન્સના કાર્યોને વધુ સારી રીતે સમજવામાં મદદ મળશે. તેના પોતાના પ્રમોટરની ક્રિયા હેઠળ વ્યક્ત કરાયેલ RGA-GFP ફ્યુઝનના અધોગતિનું વિઝ્યુલાઇઝેશન મૂળમાં કુલ GA સ્તરોના નિયમન પર મહત્વપૂર્ણ માહિતી પ્રદાન કરે છે15,16. જો કે, RGA અભિવ્યક્તિ પેશીઓમાં બદલાય છે17 અને GA18 દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. આમ, RGA પ્રમોટરની વિભેદક અભિવ્યક્તિ RGA-GFP સાથે અવલોકન કરાયેલ ફ્લોરોસેન્સ પેટર્નમાં પરિણમી શકે છે અને આમ આ પદ્ધતિ માત્રાત્મક નથી. તાજેતરમાં, બાયોએક્ટિવ ફ્લોરોસીન (Fl)-લેબલવાળા GA19,20 એ રુટ એન્ડોકોર્ટેક્સમાં GA ના સંચય અને GA પરિવહન દ્વારા તેના સેલ્યુલર સ્તરોના નિયમનનો ખુલાસો કર્યો. તાજેતરમાં, GA FRET સેન્સર nlsGPS1 એ દર્શાવ્યું કે GA સ્તર મૂળ, ફિલામેન્ટ્સ અને ડાર્ક-ગ્રોન હાઇપોકોટાઇલ્સમાં કોષ વિસ્તરણ સાથે સંબંધિત છે21. જો કે, જેમ આપણે જોયું છે, GA સાંદ્રતા એ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરતું એકમાત્ર પરિમાણ નથી, કારણ કે તે જટિલ સંવેદના પ્રક્રિયાઓ પર આધારિત છે. અહીં, DELLA અને GA સિગ્નલિંગ માર્ગોની અમારી સમજણના આધારે, અમે GA સિગ્નલિંગ માટે ડિગ્રેડેશન-આધારિત રેશિયોમેટ્રિક બાયોસેન્સરના વિકાસ અને લાક્ષણિકતાની જાણ કરીએ છીએ. આ જથ્થાત્મક બાયોસેન્સર વિકસાવવા માટે, અમે એક મ્યુટન્ટ GA-સંવેદનશીલ RGA નો ઉપયોગ કર્યો જે ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન સાથે જોડાયેલો હતો અને પેશીઓમાં સર્વવ્યાપી રીતે વ્યક્ત થતો હતો, તેમજ GA-અસંવેદનશીલ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીનનો ઉપયોગ કર્યો. અમે બતાવીએ છીએ કે મ્યુટન્ટ RGA પ્રોટીન ફ્યુઝન સર્વવ્યાપી રીતે વ્યક્ત થાય ત્યારે એન્ડોજેનસ GA સિગ્નલિંગમાં દખલ કરતા નથી, અને આ બાયોસેન્સર ઉચ્ચ સ્પેટીયોટેમ્પોરલ રિઝોલ્યુશન સાથે સેન્સિંગ ઉપકરણ દ્વારા GA ઇનપુટ અને GA સિગ્નલ પ્રોસેસિંગ બંનેમાંથી પરિણમતી સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિનું માપન કરી શકે છે. અમે આ બાયોસેન્સરનો ઉપયોગ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિના સ્પેટીયોટેમ્પોરલ વિતરણને મેપ કરવા અને SAM એપિડર્મિસમાં GA સેલ્યુલર વર્તણૂકને કેવી રીતે નિયંત્રિત કરે છે તેનું માપન કરવા માટે કર્યો. અમે દર્શાવીએ છીએ કે GA ઓર્ગન પ્રિમોર્ડિયા વચ્ચે સ્થિત SAM કોષોના ડિવિઝન પ્લેનના ઓરિએન્ટેશનને નિયંત્રિત કરે છે, જેનાથી ઇન્ટરનોડના કેનોનિકલ સેલ્યુલર સંગઠનને વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે.
છેલ્લે, અમે પૂછ્યું કે શું qmRGA વધતી જતી હાયપોકોટાઇલનો ઉપયોગ કરીને અંતર્જાત GA સ્તરોમાં ફેરફારોની જાણ કરી શકે છે. અમે અગાઉ દર્શાવ્યું હતું કે નાઈટ્રેટ GA સંશ્લેષણ વધારીને વૃદ્ધિને ઉત્તેજિત કરે છે અને બદલામાં, DELLA34 અધોગતિ. તદનુસાર, અમે અવલોકન કર્યું કે વિપુલ પ્રમાણમાં નાઈટ્રેટ પુરવઠો (10 mM NO3−) હેઠળ ઉગાડવામાં આવતા pUBQ10::qmRGA રોપાઓમાં હાયપોકોટાઇલ લંબાઈ નાઈટ્રેટ-ઉણપવાળી પરિસ્થિતિઓમાં ઉગાડવામાં આવતા રોપાઓ કરતા નોંધપાત્ર રીતે લાંબી હતી (પૂરક આકૃતિ 6a). વૃદ્ધિ પ્રતિભાવ સાથે સુસંગત, નાઈટ્રેટની ગેરહાજરીમાં ઉગાડવામાં આવતા રોપાઓ કરતા 10 mM NO3− પરિસ્થિતિઓમાં ઉગાડવામાં આવતા રોપાઓના હાયપોકોટાઇલમાં GA સિગ્નલો વધુ હતા (પૂરક આકૃતિ 6b, c). આમ, qmRGA GA સાંદ્રતામાં અંતર્જાત ફેરફારો દ્વારા પ્રેરિત GA સિગ્નલિંગમાં ફેરફારોનું નિરીક્ષણ પણ સક્ષમ કરે છે.
સેન્સર ડિઝાઇનના આધારે અપેક્ષા મુજબ, qmRGA દ્વારા શોધાયેલ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ GA સાંદ્રતા અને GA દ્રષ્ટિ પર આધાર રાખે છે કે કેમ તે સમજવા માટે, અમે વનસ્પતિ અને પ્રજનન પેશીઓમાં ત્રણ GID1 રીસેપ્ટર્સની અભિવ્યક્તિનું વિશ્લેષણ કર્યું. રોપાઓમાં, GID1-GUS રિપોર્ટર લાઇન દર્શાવે છે કે GID1a અને c કોટિલેડોન્સમાં ખૂબ જ વ્યક્ત થયા હતા (આકૃતિ 3a–c). વધુમાં, ત્રણેય રીસેપ્ટર્સ પાંદડા, બાજુના મૂળ પ્રાઇમોર્ડિયા, મૂળ ટીપ્સ (GID1b ના મૂળ કેપ સિવાય), અને વેસ્ક્યુલર સિસ્ટમ (આકૃતિ 3a–c) માં વ્યક્ત થયા હતા. પુષ્પ SAM માં, અમે ફક્ત GID1b અને 1c માટે GUS સંકેતો શોધી કાઢ્યા (પૂરક આકૃતિ 7a–c). ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશનએ આ અભિવ્યક્તિ પેટર્નની પુષ્ટિ કરી અને વધુ દર્શાવ્યું કે GID1c SAM માં નીચા સ્તરે સમાન રીતે વ્યક્ત થયું હતું, જ્યારે GID1b એ SAM ની પરિઘ પર ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિ દર્શાવી (પૂરક આકૃતિ 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ટ્રાન્સલેશનલ ફ્યુઝનથી GID1b અભિવ્યક્તિની ગ્રેડેડ રેન્જ પણ જાહેર થઈ, SAM ના કેન્દ્રમાં ઓછી અથવા કોઈ અભિવ્યક્તિથી લઈને અંગ સરહદો પર ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિ સુધી (પૂરક આકૃતિ 7m). આમ, GID1 રીસેપ્ટર્સ પેશીઓમાં અને અંદર એકસરખી રીતે વિતરિત થતા નથી. અનુગામી પ્રયોગોમાં, અમે એ પણ જોયું કે GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ના ઓવરએક્સપ્રેશનથી બાહ્ય GA એપ્લિકેશન (આકૃતિ 3d, e) માટે હાઇપોકોટાઇલ્સમાં qmRGA ની સંવેદનશીલતા વધી. તેનાથી વિપરીત, હાઇપોકોટાઇલમાં qd17mRGA દ્વારા માપવામાં આવેલ ફ્લોરોસેન્સ GA3 સારવાર (આકૃતિ 3f, g) પ્રત્યે અસંવેદનશીલ હતું. બંને પરીક્ષણો માટે, સેન્સરના ઝડપી વર્તનનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે રોપાઓને GA (100 μM GA3) ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જ્યાં GID1 રીસેપ્ટર સાથે જોડવાની ક્ષમતામાં વધારો થયો હતો અથવા ખોવાઈ ગયો હતો. એકસાથે, આ પરિણામો પુષ્ટિ કરે છે કે qmRGA બાયોસેન્સર GA અને GA સેન્સર તરીકે સંયુક્ત કાર્ય કરે છે, અને સૂચવે છે કે GID1 રીસેપ્ટરની વિભેદક અભિવ્યક્તિ સેન્સરની ઉત્સર્જનતાને નોંધપાત્ર રીતે મોડ્યુલેટ કરી શકે છે.
આજ સુધી, SAM માં GA સિગ્નલોનું વિતરણ અસ્પષ્ટ રહે છે. તેથી, અમે GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિના ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન જથ્થાત્મક નકશાઓની ગણતરી કરવા માટે qmRGA-એક્સપ્રેસિંગ પ્લાન્ટ્સ અને pCLV3::mCherry-NLS સ્ટેમ સેલ રિપોર્ટર35 નો ઉપયોગ કર્યો, L1 સ્તર (એપિડર્મિસ; આકૃતિ 4a, b, પદ્ધતિઓ અને પૂરક પદ્ધતિઓ જુઓ) પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું, કારણ કે L1 SAM વૃદ્ધિને નિયંત્રિત કરવામાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે36. અહીં, pCLV3::mCherry-NLS અભિવ્યક્તિએ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ37 ના અવકાશી-ટેમ્પોરલ વિતરણનું વિશ્લેષણ કરવા માટે એક નિશ્ચિત ભૌમિતિક સંદર્ભ બિંદુ પ્રદાન કર્યું. જોકે GA ને બાજુના અંગ વિકાસ4 માટે આવશ્યક માનવામાં આવે છે, અમે અવલોકન કર્યું કે P3 સ્ટેજ (આકૃતિ 4a, b) થી શરૂ થતા ફ્લોરલ પ્રિમોર્ડિયમ (P) માં GA સિગ્નલો ઓછા હતા, જ્યારે યુવાન P1 અને P2 પ્રિમોર્ડિયમમાં મધ્ય પ્રદેશ (આકૃતિ 4a, b) જેવી જ મધ્યમ પ્રવૃત્તિ હતી. ઓર્ગન પ્રિમોર્ડિયમ સીમાઓ પર ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ જોવા મળી હતી, જે P1/P2 (સીમાની બાજુઓ પર) થી શરૂ થાય છે અને P4 પર ટોચ પર પહોંચે છે, તેમજ પ્રિમોર્ડિયા (આકૃતિ 4a, b અને પૂરક આકૃતિ 8a, b) વચ્ચે સ્થિત પેરિફેરલ પ્રદેશના તમામ કોષોમાં જોવા મળી હતી. આ ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ ફક્ત બાહ્ય ત્વચામાં જ નહીં પરંતુ L2 અને ઉપલા L3 સ્તરોમાં પણ જોવા મળી હતી (પૂરક આકૃતિ 8b). qmRGA નો ઉપયોગ કરીને SAM માં શોધાયેલ GA સિગ્નલોની પેટર્ન પણ સમય જતાં યથાવત રહી (પૂરક આકૃતિ 8c–f, k). જોકે qd17mRGA રચના પાંચ સ્વતંત્ર રેખાઓમાંથી T3 છોડના SAM માં વ્યવસ્થિત રીતે ડાઉનરેગ્યુલેટ કરવામાં આવી હતી જેને અમે વિગતવાર દર્શાવી હતી, અમે pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP રચના (પૂરક આકૃતિ 8g–j, l) સાથે મેળવેલા ફ્લોરોસેન્સ પેટર્નનું વિશ્લેષણ કરવામાં સક્ષમ હતા. આ નિયંત્રણ રેખામાં, SAM માં ફ્લોરોસેન્સ રેશિયોમાં ફક્ત નાના ફેરફારો જ જોવા મળ્યા હતા, પરંતુ SAM કેન્દ્રમાં અમે TagBFP સાથે સંકળાયેલ VENUS માં સ્પષ્ટ અને અણધારી ઘટાડો જોયો. આ પુષ્ટિ કરે છે કે qmRGA દ્વારા અવલોકન કરાયેલ સિગ્નલિંગ પેટર્ન mRGA-VENUS ના GA-આધારિત અધોગતિને પ્રતિબિંબિત કરે છે, પરંતુ એ પણ દર્શાવે છે કે qmRGA મેરિસ્ટેમ સેન્ટરમાં GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિને વધુ પડતો અંદાજ આપી શકે છે. સારાંશમાં, અમારા પરિણામો GA સિગ્નલિંગ પેટર્ન જાહેર કરે છે જે મુખ્યત્વે પ્રિમોર્ડિયાના વિતરણને પ્રતિબિંબિત કરે છે. ઇન્ટર-પ્રાઇમોર્ડિયલ રિજન (IPR) નું આ વિતરણ વિકાસશીલ પ્રિમોર્ડિયમ અને મધ્ય પ્રદેશ વચ્ચે ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિની ધીમે ધીમે સ્થાપનાને કારણે છે, જ્યારે તે જ સમયે પ્રિમોર્ડિયમમાં GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ ઘટે છે (આકૃતિ 4c, d).
GID1b અને GID1c રીસેપ્ટર્સનું વિતરણ (ઉપર જુઓ) સૂચવે છે કે GA રીસેપ્ટર્સની વિભેદક અભિવ્યક્તિ SAM માં GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિના પેટર્નને આકાર આપવામાં મદદ કરે છે. અમે વિચાર્યું કે GA ના વિભેદક સંચયમાં શું સામેલ હોઈ શકે છે. આ શક્યતાની તપાસ કરવા માટે, અમે nlsGPS1 GA FRET સેન્સર21 નો ઉપયોગ કર્યો. 100 મિનિટ માટે 10 μM GA4+7 સાથે સારવાર કરાયેલ nlsGPS1 ના SAM માં વધેલી સક્રિયકરણ આવર્તન શોધી કાઢવામાં આવી હતી (પૂરક આકૃતિ 9a–e), જે દર્શાવે છે કે nlsGPS1 SAM માં GA સાંદ્રતામાં ફેરફારને પ્રતિભાવ આપે છે, જેમ કે તે મૂળ21 માં કરે છે. nlsGPS1 સક્રિયકરણ આવર્તનના અવકાશી વિતરણથી SAM ના બાહ્ય સ્તરોમાં પ્રમાણમાં નીચા GA સ્તરો જાહેર થયા, પરંતુ દર્શાવ્યું કે તેઓ કેન્દ્રમાં અને SAM ની સરહદો પર ઉંચા હતા (આકૃતિ 4e અને પૂરક આકૃતિ 9a,c). આ સૂચવે છે કે GA પણ SAM માં qmRGA દ્વારા જાહેર કરાયેલ અવકાશી પેટર્ન સાથે વિતરિત થાય છે. પૂરક અભિગમ તરીકે, અમે ફ્લોરોસન્ટ GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) અથવા ફક્ત Fl સાથે SAM ને નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે પણ સારવાર આપી. Fl સિગ્નલ સમગ્ર SAM માં વિતરિત કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં મધ્ય પ્રદેશ અને પ્રિમોર્ડિયમનો સમાવેશ થાય છે, જોકે ઓછી તીવ્રતા પર (આકૃતિ 4j અને પૂરક આકૃતિ 10d). તેનાથી વિપરીત, ત્રણેય GA-Fl ખાસ કરીને પ્રિમોર્ડિયમ સીમાઓની અંદર અને બાકીના IPR માં વિવિધ ડિગ્રીઓ સુધી સંચિત થયા, જેમાં GA7-Fl IPR માં સૌથી મોટા ડોમેનમાં સંચિત થયા (આકૃતિ 4k અને પૂરક આકૃતિ 10a,b). ફ્લોરોસન્સ તીવ્રતાના જથ્થાત્મકકરણથી જાણવા મળ્યું કે Fl-સારવાર કરાયેલ SAM (આકૃતિ 4l અને પૂરક આકૃતિ 10c) ની તુલનામાં GA-Fl-સારવાર કરાયેલ SAM માં IPR થી બિન-IPR તીવ્રતા ગુણોત્તર વધારે હતો. એકસાથે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે GA અંગ સરહદની સૌથી નજીક સ્થિત IPR કોષોમાં ઉચ્ચ સાંદ્રતા પર હાજર છે. આ સૂચવે છે કે SAM GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિની પેટર્ન GA રીસેપ્ટર્સની વિભેદક અભિવ્યક્તિ અને અંગ સરહદોની નજીક IPR કોષોમાં GA ના વિભેદક સંચય બંનેમાંથી પરિણમે છે. આમ, અમારા વિશ્લેષણમાં GA સિગ્નલિંગની અણધારી અવકાશીય ટેમ્પોરલ પેટર્ન જાહેર થઈ, જેમાં SAM ના કેન્દ્ર અને પ્રાથમિક ક્ષેત્રમાં ઓછી પ્રવૃત્તિ અને પેરિફેરલ ક્ષેત્રમાં IPR માં વધુ પ્રવૃત્તિ હતી.
SAM માં વિભેદક GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિની ભૂમિકાને સમજવા માટે, અમે SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS ના રીઅલ-ટાઇમ ટાઇમ-લેપ્સ ઇમેજિંગનો ઉપયોગ કરીને GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ, કોષ વિસ્તરણ અને કોષ વિભાજન વચ્ચેના સહસંબંધનું વિશ્લેષણ કર્યું. વૃદ્ધિ નિયમનમાં GA ની ભૂમિકાને ધ્યાનમાં રાખીને, કોષ વિસ્તરણ પરિમાણો સાથે સકારાત્મક સહસંબંધ અપેક્ષિત હતો. તેથી, અમે સૌપ્રથમ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ નકશાઓની તુલના કોષ સપાટી વૃદ્ધિ દરના નકશા સાથે કરી (આપેલ કોષ માટે અને વિભાજન સમયે પુત્રી કોષો માટે કોષ વિસ્તરણની શક્તિ માટે પ્રોક્સી તરીકે) અને વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપીના નકશા સાથે, જે કોષ વિસ્તરણની દિશાને માપે છે (આપેલ કોષ માટે અને વિભાજન સમયે પુત્રી કોષો માટે પણ અહીં ઉપયોગ થાય છે; આકૃતિ 5a,b, પદ્ધતિઓ અને પૂરક પદ્ધતિઓ જુઓ). SAM કોષ સપાટી વૃદ્ધિ દરના અમારા નકશા અગાઉના અવલોકનો સાથે સુસંગત છે38,39, સરહદ પર ન્યૂનતમ વૃદ્ધિ દર અને વિકાસશીલ ફૂલોમાં મહત્તમ વૃદ્ધિ દર સાથે (આકૃતિ 5a). મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) દર્શાવે છે કે GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ કોષ સપાટી વૃદ્ધિ તીવ્રતા (આકૃતિ 5c) સાથે નકારાત્મક રીતે સંબંધિત હતી. અમે એ પણ દર્શાવ્યું કે GA સિગ્નલિંગ ઇનપુટ અને વૃદ્ધિ તીવ્રતા સહિત વિવિધતાના મુખ્ય અક્ષો, ઉચ્ચ CLV3 અભિવ્યક્તિ દ્વારા નિર્ધારિત દિશામાં ઓર્થોગોનલ હતા, જે બાકીના વિશ્લેષણમાં SAM કેન્દ્રમાંથી કોષોના બાકાત હોવાની પુષ્ટિ કરે છે. સ્પીયરમેન સહસંબંધ વિશ્લેષણે PCA પરિણામો (આકૃતિ 5d) ની પુષ્ટિ કરી, જે દર્શાવે છે કે IPR માં ઉચ્ચ GA સિગ્નલો ઉચ્ચ કોષ વિસ્તરણમાં પરિણમ્યા નથી. જો કે, સહસંબંધ વિશ્લેષણ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ અને વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી (આકૃતિ 5c, d) વચ્ચે થોડો હકારાત્મક સહસંબંધ દર્શાવે છે, જે સૂચવે છે કે IPR માં ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ કોષ વૃદ્ધિની દિશા અને સંભવતઃ કોષ વિભાજન સમતલની સ્થિતિને પ્રભાવિત કરે છે.
a, b SAM માં સરેરાશ સપાટી વૃદ્ધિ (a) અને વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી (b) ના ગરમીના નકશા સરેરાશ સાત સ્વતંત્ર છોડ (અનુક્રમે કોષ વિસ્તરણની શક્તિ અને દિશા માટે પ્રોક્સી તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે) પર આધારિત હતા. c PCA વિશ્લેષણમાં નીચેના ચલો શામેલ હતા: GA સિગ્નલ, સપાટી વૃદ્ધિ તીવ્રતા, સપાટી વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી અને CLV3 અભિવ્યક્તિ. PCA ઘટક 1 મુખ્યત્વે સપાટી વૃદ્ધિ તીવ્રતા સાથે નકારાત્મક રીતે સહસંબંધિત હતો અને GA સિગ્નલ સાથે હકારાત્મક રીતે સહસંબંધિત હતો. PCA ઘટક 2 મુખ્યત્વે સપાટી વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી સાથે હકારાત્મક રીતે સહસંબંધિત હતો અને CLV3 અભિવ્યક્તિ સાથે નકારાત્મક રીતે સહસંબંધિત હતો. ટકાવારી દરેક ઘટક દ્વારા સમજાવાયેલ વિવિધતાનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. d CZ સિવાય પેશી સ્કેલ પર GA સિગ્નલ, સપાટી વૃદ્ધિ તીવ્રતા અને સપાટી વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી વચ્ચે સ્પીયરમેન સહસંબંધ વિશ્લેષણ. જમણી બાજુની સંખ્યા બે ચલો વચ્ચે સ્પીયરમેન rho મૂલ્ય છે. ફૂદડી એવા કિસ્સાઓ સૂચવે છે જ્યાં સહસંબંધ/નકારાત્મક સહસંબંધ ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે. e કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા કોલ-0 SAM L1 કોષોનું 3D વિઝ્યુલાઇઝેશન. 10 કલાકે SAM (પરંતુ પ્રિમોર્ડિયમ નહીં) માં રચાયેલી નવી કોષ દિવાલો તેમના કોણ મૂલ્યો અનુસાર રંગીન હોય છે. રંગ પટ્ટી નીચેના જમણા ખૂણામાં બતાવવામાં આવી છે. ઇનસેટ 0 કલાકે અનુરૂપ 3D છબી બતાવે છે. સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત થયો. f બોક્સ પ્લોટ IPR અને બિન-IPR કોલ-0 SAM (n = 10 સ્વતંત્ર છોડ) માં કોષ વિભાજન દર દર્શાવે છે. મધ્ય રેખા મધ્યક દર્શાવે છે, અને બોક્સ સીમાઓ 25મી અને 75મી ટકાવારી દર્શાવે છે. મૂછો R સોફ્ટવેર સાથે નિર્ધારિત લઘુત્તમ અને મહત્તમ મૂલ્યો દર્શાવે છે. P મૂલ્યો વેલ્ચના બે-પૂંછડીવાળા ટી-ટેસ્ટ સાથે મેળવવામાં આવ્યા હતા. g, h યોજનાકીય આકૃતિ દર્શાવે છે કે (g) SAM ના કેન્દ્રથી રેડિયલ દિશાના સંદર્ભમાં નવી કોષ દિવાલ (મેજેન્ટા) ના ખૂણાને કેવી રીતે માપવા (સફેદ ડોટેડ રેખા) (માત્ર તીવ્ર કોણ મૂલ્યો, એટલે કે, 0–90°, ધ્યાનમાં લેવામાં આવે છે), અને (h) મેરિસ્ટેમની અંદર પરિઘ/બાજુ અને રેડિયલ દિશાઓ. i SAM (ઘેરો વાદળી), IPR (મધ્યમ વાદળી) અને નોન-IPR (આછો વાદળી) માં કોષ વિભાજન સમતલ દિશા નિર્દેશના ફ્રીક્વન્સી હિસ્ટોગ્રામ. P મૂલ્યો બે-પૂંછડીવાળા કોલ્મોગોરોવ-સ્મિર્નોવ પરીક્ષણ દ્વારા મેળવવામાં આવ્યા હતા. સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત થયો હતો. j અનુક્રમે P3 (આછો લીલો), P4 (મધ્યમ લીલો) અને P5 (ઘેરો લીલો) ની આસપાસ IPR ના કોષ વિભાજન સમતલ દિશા નિર્દેશના ફ્રીક્વન્સી હિસ્ટોગ્રામ. P મૂલ્યો બે-પૂંછડીવાળા કોલ્મોગોરોવ-સ્મિર્નોવ પરીક્ષણ દ્વારા મેળવવામાં આવ્યા હતા. સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત થયો હતો.
તેથી, અમે આગળ પરીક્ષણ દરમિયાન નવી રચાયેલી કોષ દિવાલોને ઓળખીને GA સિગ્નલિંગ અને કોષ વિભાજન પ્રવૃત્તિ વચ્ચેના સહસંબંધની તપાસ કરી (આકૃતિ 5e). આ અભિગમથી અમને કોષ વિભાજનની આવર્તન અને દિશા માપવાની મંજૂરી મળી. આશ્ચર્યજનક રીતે, અમને જાણવા મળ્યું કે IPR અને બાકીના SAM (નોન-IPR, આકૃતિ 5f) માં કોષ વિભાજનની આવર્તન સમાન હતી, જે દર્શાવે છે કે IPR અને નોન-IPR કોષો વચ્ચે GA સિગ્નલિંગમાં તફાવત કોષ વિભાજનને નોંધપાત્ર રીતે અસર કરતા નથી. આ, અને GA સિગ્નલિંગ અને વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી વચ્ચેના હકારાત્મક સહસંબંધે, અમને વિચારવા માટે પ્રેરિત કર્યા કે શું GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ કોષ વિભાજન સમતલના દિશાને પ્રભાવિત કરી શકે છે. અમે મેરિસ્ટેમ સેન્ટર અને નવી કોષ દિવાલના કેન્દ્રને જોડતા રેડિયલ અક્ષની તુલનામાં એક તીવ્ર કોણ તરીકે નવી કોષ દિવાલની દિશા માપી (આકૃતિ 5e-i) અને રેડિયલ અક્ષની તુલનામાં 90° ની નજીકના ખૂણા પર કોષોનું વિભાજન થવાની સ્પષ્ટ વૃત્તિ જોઈ, જેમાં સૌથી વધુ ફ્રીક્વન્સી 70–80° (23.28%) અને 80–90° (22.62%) (આકૃતિ 5e,i) પર જોવા મળી, જે પરિઘ/ટ્રાન્સવર્સ દિશામાં કોષ વિભાજનને અનુરૂપ છે (આકૃતિ 5h). આ કોષ વિભાજન વર્તણૂકમાં GA સિગ્નલિંગના યોગદાનની તપાસ કરવા માટે, અમે IPR અને બિન-IPR માં કોષ વિભાજન પરિમાણોનું અલગથી વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 5i). અમે જોયું કે IPR કોષોમાં વિભાજન કોણ વિતરણ નોન-IPR કોષો અથવા સમગ્ર SAM માં કોષો કરતા અલગ હતું, IPR કોષો બાજુની/ગોળાકાર કોષ વિભાજનનું પ્રમાણ વધારે દર્શાવે છે, એટલે કે, 70-80° અને 80-90° (અનુક્રમે 33.86% અને 30.71%, અનુરૂપ પ્રમાણ) (આકૃતિ 5i). આમ, અમારા અવલોકનોએ ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ અને પરિઘ દિશાની નજીક કોષ વિભાજન સમતલ દિશા વચ્ચેનો સંબંધ જાહેર કર્યો, જે GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ અને વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી (આકૃતિ 5c, d) વચ્ચેના સહસંબંધ જેવો જ છે. આ જોડાણના અવકાશી સંરક્ષણને વધુ સ્થાપિત કરવા માટે, અમે P3 થી શરૂ કરીને પ્રિમોર્ડિયમની આસપાસના IPR કોષોમાં વિભાજન સમતલ દિશા માપી, કારણ કે P4 થી શરૂ કરીને આ પ્રદેશમાં સૌથી વધુ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ મળી આવી હતી (આકૃતિ 4). P3 અને P4 ની આસપાસ IPR ના વિભાજન ખૂણાઓએ કોઈ આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવ્યા નથી, જોકે P4 ની આસપાસ IPR માં બાજુની કોષ વિભાજનની વધેલી આવૃત્તિ જોવા મળી હતી (આકૃતિ 5j). જોકે, P5 ની આસપાસના IPR કોષોમાં, કોષ વિભાજન સમતલના દિશા નિર્દેશમાં તફાવત આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર બન્યો, જેમાં ટ્રાંસવર્સ કોષ વિભાજનની આવર્તનમાં તીવ્ર વધારો થયો (આકૃતિ 5j). એકસાથે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે GA સિગ્નલિંગ SAM માં કોષ વિભાજનના દિશા નિર્દેશનને નિયંત્રિત કરી શકે છે, જે અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે40,41 કે ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ IPR માં કોષ વિભાજનના લેટરલ દિશા નિર્દેશને પ્રેરિત કરી શકે છે.
એવી આગાહી કરવામાં આવી છે કે IPR માં કોષો પ્રિમોર્ડિયામાં નહીં પરંતુ ઇન્ટરનોડ્સમાં સમાવિષ્ટ થશે2,42,43. IPR માં કોષ વિભાજનનું ત્રાંસી દિશા ઇન્ટરનોડ્સમાં બાહ્ય કોષોની સમાંતર રેખાંશ પંક્તિઓના લાક્ષણિક સંગઠનમાં પરિણમી શકે છે. ઉપર વર્ણવેલ અમારા અવલોકનો સૂચવે છે કે GA સિગ્નલિંગ કોષ વિભાજનની દિશાને નિયંત્રિત કરીને આ પ્રક્રિયામાં ભૂમિકા ભજવે છે.
ઘણા DELLA જનીનોના કાર્યમાં ઘટાડો થવાથી રચનાત્મક GA પ્રતિભાવ થાય છે, અને આ પૂર્વધારણાનું પરીક્ષણ કરવા માટે ડેલા મ્યુટન્ટ્સનો ઉપયોગ કરી શકાય છે44. અમે સૌપ્રથમ SAM માં પાંચ DELLA જનીનોના અભિવ્યક્તિ પેટર્નનું વિશ્લેષણ કર્યું. GUS લાઇન45 ના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ફ્યુઝનથી જાણવા મળ્યું કે GAI, RGA, RGL1, અને RGL2 (ઘણી ઓછી હદ સુધી) SAM માં વ્યક્ત થયા હતા (પૂરક આકૃતિ 11a–d). ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશન એ વધુ દર્શાવ્યું કે GAI mRNA ખાસ કરીને પ્રિમોર્ડિયા અને વિકાસશીલ ફૂલોમાં સંચિત થાય છે (પૂરક આકૃતિ 11e). RGL1 અને RGL3 mRNA સમગ્ર SAM કેનોપીમાં અને જૂના ફૂલોમાં શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે RGL2 mRNA સરહદી પ્રદેશમાં વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા (પૂરક આકૃતિ 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM ની કોન્ફોકલ ઇમેજિંગે ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશન દ્વારા અવલોકન કરાયેલ અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ કરી અને દર્શાવ્યું કે RGL3 પ્રોટીન SAM ના મધ્ય ભાગમાં સંચિત થાય છે (પૂરક આકૃતિ 11i). pRGA::GFP-RGA રેખાનો ઉપયોગ કરીને, અમે એ પણ જોયું કે RGA પ્રોટીન SAM માં એકઠું થાય છે, પરંતુ P4 થી શરૂ થતી સરહદ પર તેની વિપુલતા ઘટે છે (પૂરક આકૃતિ 11j). નોંધનીય છે કે, RGL3 અને RGA ના અભિવ્યક્તિ પેટર્ન IPR માં ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ સાથે સુસંગત છે, જેમ કે qmRGA (આકૃતિ 4) દ્વારા શોધાયેલ છે. વધુમાં, આ ડેટા સૂચવે છે કે બધા DELLA SAM માં વ્યક્ત થાય છે અને તેમની અભિવ્યક્તિ સામૂહિક રીતે સમગ્ર SAM ને આવરી લે છે.
અમે આગળ વાઇલ્ડ-ટાઇપ SAM (Ler, કંટ્રોલ) અને gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 ડેલા ક્વિન્ટુપલ (ગ્લોબલ) મ્યુટન્ટ્સ (આકૃતિ 6a, b) માં કોષ વિભાજન પરિમાણોનું વિશ્લેષણ કર્યું. રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમે ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ SAM માં વાઇલ્ડ પ્રકાર (આકૃતિ 6c) ની તુલનામાં કોષ વિભાજન કોણ ફ્રીક્વન્સીઝના વિતરણમાં આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર ફેરફાર જોયો. ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટમાં આ ફેરફાર 80-90° ખૂણા (34.71% વિરુદ્ધ 24.55%) અને ઓછા અંશે, 70-80° ખૂણા (23.78% વિરુદ્ધ 20.18%) ની આવર્તનમાં વધારાને કારણે હતો, એટલે કે, ટ્રાન્સવર્સ કોષ વિભાજન (આકૃતિ 6c) ને અનુરૂપ. ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ (આકૃતિ 6c) માં નોન-ટ્રાન્સવર્સ ડિવિઝન (0-60°) ની આવર્તન પણ ઓછી હતી. ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ (આકૃતિ 6b) ના SAM માં ટ્રાંસવર્સ સેલ ડિવિઝનની આવૃત્તિ નોંધપાત્ર રીતે વધી હતી. ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટમાં વાઇલ્ડ પ્રકાર (આકૃતિ 6d) ની તુલનામાં IPR માં ટ્રાંસવર્સ સેલ ડિવિઝનની આવૃત્તિ પણ વધુ હતી. IPR ક્ષેત્રની બહાર, વાઇલ્ડ પ્રકારમાં કોષ વિભાજન ખૂણાઓનું વધુ સમાન વિતરણ હતું, જ્યારે ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ IPR (આકૃતિ 6e) જેવા ટેન્જેન્શિયલ ડિવિઝનને પસંદ કરતા હતા. અમે ga2 ઓક્સિડેઝ (ga2ox) ક્વિન્ટુપલ મ્યુટન્ટ્સ (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, અને ga2ox6-2) ના SAM માં કોષ વિભાજનના દિશાનિર્દેશનું પણ પ્રમાણ નક્કી કર્યું, જે GA-નિષ્ક્રિય મ્યુટન્ટ પૃષ્ઠભૂમિ છે જેમાં GA એકઠા થાય છે. GA સ્તરમાં વધારા સાથે સુસંગત, ક્વિન્ટુપલ ga2ox મ્યુટન્ટ ઇન્ફ્લોરેન્સન્સનો SAM કોલ-0 (પૂરક આકૃતિ 12a, b) કરતા મોટો હતો, અને કોલ-0 ની તુલનામાં, ક્વિન્ટુપલ ga2ox SAM એ કોષ વિભાજન ખૂણાઓનું સ્પષ્ટ રીતે અલગ વિતરણ દર્શાવ્યું, કોણ આવર્તન 50° થી 90° સુધી વધ્યું, એટલે કે ફરીથી સ્પર્શક વિભાગોની તરફેણ કરી (પૂરક આકૃતિ 12a–c). આમ, આપણે બતાવીએ છીએ કે GA સિગ્નલિંગ અને GA સંચયનું રચનાત્મક સક્રિયકરણ IPR અને બાકીના SAM માં બાજુના કોષ વિભાજનને પ્રેરિત કરે છે.
a, b કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને PI-સ્ટેઇન્ડ Ler (a) અને ગ્લોબલ ડેલા મ્યુટન્ટ (b) SAM ના L1 સ્તરનું 3D વિઝ્યુલાઇઝેશન. 10-કલાકના સમયગાળા દરમિયાન SAM (પરંતુ પ્રિમોર્ડિયમ નહીં) માં રચાયેલી નવી કોષ દિવાલો તેમના કોણ મૂલ્યો અનુસાર બતાવવામાં આવે છે અને રંગીન કરવામાં આવે છે. ઇનસેટ 0 કલાક પર SAM બતાવે છે. રંગ પટ્ટી નીચેના જમણા ખૂણામાં પ્રદર્શિત થાય છે. (b) માં તીર ગ્લોબલ ડેલા મ્યુટન્ટમાં સંરેખિત સેલ ફાઇલોના ઉદાહરણ તરફ નિર્દેશ કરે છે. સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત થયો હતો. ce સમગ્ર SAM (d), IPR (e), અને નોન-IPR (f) માં Ler અને ગ્લોબલ ડેલા વચ્ચે કોષ વિભાજન પ્લેન ઓરિએન્ટેશનના ફ્રીક્વન્સી વિતરણની સરખામણી. બે-પૂંછડીવાળા કોલમોગોરોવ-સ્મિરનોવ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને P મૂલ્યો મેળવવામાં આવ્યા હતા. f, g કોલ-0 (i) અને pCUC2::gai-1-VENUS (j) ટ્રાન્સજેનિક છોડના PI-સ્ટેઇન્ડ SAM ની કોન્ફોકલ છબીઓનું 3D વિઝ્યુલાઇઝેશન. પેનલ્સ (a, b) 10 કલાકની અંદર SAM માં રચાયેલી નવી કોષ દિવાલો (પરંતુ પ્રાઇમોર્ડિયા નહીં) દર્શાવે છે. સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત થયો. h–j સમગ્ર SAM (h), IPR (i) અને નોન-IPR (j) માં સ્થિત કોષ વિભાજન પ્લેન ઓરિએન્ટેશનના આવર્તન વિતરણની સરખામણી Col-0 અને pCUC2::gai-1-VENUS છોડ વચ્ચે. P મૂલ્યો બે-પૂંછડીવાળા કોલમોગોરોવ-સ્મિર્નોવ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યા હતા.
અમે આગળ IPR માં ખાસ કરીને GA સિગ્નલિંગને અવરોધિત કરવાની અસરનું પરીક્ષણ કર્યું. આ માટે, અમે VENUS (pCUC2::gai-1-VENUS લાઇનમાં) સાથે જોડાયેલા પ્રભાવશાળી નકારાત્મક gai-1 પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિ ચલાવવા માટે કોટિલેડોન કપ 2 (CUC2) પ્રમોટરનો ઉપયોગ કર્યો. જંગલી-પ્રકારના SAM માં, CUC2 પ્રમોટર P4 થી સરહદ કોષો સહિત SAM માં મોટાભાગના IPR ની અભિવ્યક્તિ ચલાવે છે, અને pCUC2::gai-1-VENUS છોડમાં સમાન ચોક્કસ અભિવ્યક્તિ જોવા મળી હતી (નીચે જુઓ). pCUC2::gai-1-VENUS છોડના SAM અથવા IPR માં કોષ વિભાજન ખૂણાઓનું વિતરણ જંગલી પ્રકારના છોડ કરતા નોંધપાત્ર રીતે અલગ નહોતું, જોકે અણધારી રીતે અમને જાણવા મળ્યું કે આ છોડમાં IPR વગરના કોષો 80-90° (આકૃતિ 6f-j) ની ઉચ્ચ આવર્તન પર વિભાજિત થાય છે.
એવું સૂચવવામાં આવ્યું છે કે કોષ વિભાજનની દિશા SAM ની ભૂમિતિ પર આધાર રાખે છે, ખાસ કરીને પેશી વક્રતા દ્વારા ઉત્પન્ન થતા તાણ તણાવ પર. તેથી અમે પૂછ્યું કે શું ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ અને pCUC2::gai-1-VENUS છોડમાં SAM ના આકારમાં ફેરફાર થયો હતો. અગાઉ અહેવાલ મુજબ12, ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ SAM નું કદ જંગલી પ્રકાર કરતા મોટું હતું (પૂરક આકૃતિ 13a, b, d). CLV3 અને STM RNA ના ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશનથી ડેલા મ્યુટન્ટ્સમાં મેરિસ્ટેમ વિસ્તરણની પુષ્ટિ થઈ અને સ્ટેમ સેલ નિશનું બાજુનું વિસ્તરણ પણ દર્શાવવામાં આવ્યું (પૂરક આકૃતિ 13e, f, h, i). જો કે, બંને જીનોટાઇપ્સમાં SAM વક્રતા સમાન હતી (પૂરક આકૃતિ 13k, m, n, p). અમે જંગલી પ્રકારની સરખામણીમાં વક્રતામાં ફેરફાર કર્યા વિના gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 ડેલા ક્વાડ્રુપલ મ્યુટન્ટમાં કદમાં સમાન વધારો જોયો (પૂરક આકૃતિ 13c, d, g, j, l, o, p). ડેલા ક્વાડ્રુપલ મ્યુટન્ટમાં કોષ વિભાજન દિશાની આવર્તન પણ પ્રભાવિત થઈ હતી, પરંતુ ડેલા મોનોલિથિક મ્યુટન્ટ (પૂરક આકૃતિ 12d–f) કરતા ઓછી હદ સુધી. આ ડોઝ અસર, વક્રતા પર અસરના અભાવ સાથે, સૂચવે છે કે ડેલા ક્વાડ્રુપલ મ્યુટન્ટમાં શેષ RGL3 પ્રવૃત્તિ DELLA પ્રવૃત્તિના નુકસાનને કારણે કોષ વિભાજન દિશાના ફેરફારોને મર્યાદિત કરે છે અને બાજુના કોષ વિભાજનમાં ફેરફારો SAM ભૂમિતિમાં ફેરફારોને બદલે GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિમાં ફેરફારોના પ્રતિભાવમાં થાય છે. ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ, CUC2 પ્રમોટર P4 થી શરૂ થતા SAM માં IPR અભિવ્યક્તિ ચલાવે છે (પૂરક આકૃતિ 14a, b), અને તેનાથી વિપરીત, pCUC2::gai-1-VENUS SAM નું કદ ઓછું હતું પરંતુ વક્રતા વધારે હતી (પૂરક આકૃતિ 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM મોર્ફોલોજીમાં આ ફેરફાર જંગલી પ્રકારની તુલનામાં યાંત્રિક તાણના અલગ વિતરણમાં પરિણમી શકે છે, જેમાં ઉચ્ચ પરિઘ તાણ SAM કેન્દ્રથી ટૂંકા અંતરે શરૂ થાય છે47. વૈકલ્પિક રીતે, pCUC2::gai-1-VENUS SAM મોર્ફોલોજીમાં ફેરફારો ટ્રાન્સજીન અભિવ્યક્તિ48 દ્વારા પ્રેરિત પ્રાદેશિક યાંત્રિક ગુણધર્મોમાં ફેરફારોને કારણે થઈ શકે છે. બંને કિસ્સાઓમાં, આ GA સિગ્નલિંગમાં ફેરફારોની અસરોને આંશિક રીતે સરભર કરી શકે છે, જે કોષો પરિઘ/ટ્રાન્સવર્સ ઓરિએન્ટેશનમાં વિભાજીત થવાની સંભાવનાને વધારીને અમારા અવલોકનોને સમજાવે છે.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારા ડેટા પુષ્ટિ કરે છે કે ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ IPR માં કોષ વિભાજન સમતલના બાજુના દિશા નિર્દેશનમાં સક્રિય ભૂમિકા ભજવે છે. તેઓ એ પણ દર્શાવે છે કે મેરિસ્ટેમ વક્રતા IPR માં કોષ વિભાજન સમતલના દિશા નિર્દેશને પણ પ્રભાવિત કરે છે.
IPR માં ડિવિઝન પ્લેનનું ટ્રાન્સવર્સ ઓરિએન્ટેશન, ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિને કારણે, સૂચવે છે કે GA એ SAM ની અંદર એપિડર્મિસમાં રેડિયલ સેલ ફાઇલને પૂર્વ-આયોજિત કરે છે જેથી સેલ્યુલર સંગઠનને વ્યાખ્યાયિત કરી શકાય જે પાછળથી એપિડર્મલ ઇન્ટરનોડમાં જોવા મળશે. ખરેખર, આવી સેલ ફાઇલો ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ્સની SAM છબીઓમાં વારંવાર દેખાતી હતી (આકૃતિ 6b). આમ, SAM માં GA સિગ્નલિંગના અવકાશી પેટર્નના વિકાસલક્ષી કાર્યનું વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે વાઇલ્ડ-ટાઇપ (Ler અને Col-0), ડેલા ગ્લોબલ મ્યુટન્ટ્સ અને pCUC2::gai-1-VENUS ટ્રાન્સજેનિક પ્લાન્ટ્સમાં IPR માં કોષોના અવકાશી સંગઠનનું વિશ્લેષણ કરવા માટે ટાઇમ-લેપ્સ ઇમેજિંગનો ઉપયોગ કર્યો.
અમને જાણવા મળ્યું કે qmRGA દર્શાવે છે કે IPR માં GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ P1/P2 થી વધીને P4 પર પહોંચી ગઈ છે, અને આ પેટર્ન સમય જતાં સ્થિર રહી છે (આકૃતિ 4a–f અને પૂરક આકૃતિ 8c–f, k). વધતા GA સિગ્નલ સાથે IPR માં કોષોના અવકાશી સંગઠનનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, અમે પ્રથમ અવલોકન પછી 34 કલાક પછી વિશ્લેષણ કરાયેલ તેમના વિકાસના ભાગ્ય અનુસાર P4 ની ઉપર અને બાજુઓ પર Ler IPR કોષોને લેબલ કર્યા, એટલે કે, બે કરતા વધુ પ્લાસ્ટીડ સમય, જે અમને P1/P2 થી P4 સુધી પ્રિમોર્ડિયમ વિકાસ દરમિયાન IPR કોષોને અનુસરવાની મંજૂરી આપે છે. અમે ત્રણ અલગ અલગ રંગોનો ઉપયોગ કર્યો: P4 ની નજીક પ્રિમોર્ડિયમમાં સંકલિત કોષો માટે પીળો, IPR માં રહેલા કોષો માટે લીલો, અને બંને પ્રક્રિયાઓમાં ભાગ લેનારાઓ માટે જાંબલી (આકૃતિ 7a–c). t0 (0 h) પર, P4 ની સામે IPR કોષોના 1-2 સ્તરો દૃશ્યમાન હતા (આકૃતિ 7a). અપેક્ષા મુજબ, જ્યારે આ કોષો વિભાજીત થયા, ત્યારે તેઓ મુખ્યત્વે ટ્રાંસવર્સ ડિવિઝન પ્લેન (આકૃતિઓ 7a–c) દ્વારા આમ કર્યું. કોલ-0 SAM (P3 પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરીને, જેની સરહદ Ler માં P4 ની જેમ ફોલ્ડ થાય છે) નો ઉપયોગ કરીને સમાન પરિણામો પ્રાપ્ત થયા, જોકે આ જીનોટાઇપમાં ફ્લોરલ બોર્ડર પર રચાયેલ ફોલ્ડ IPR કોષોને વધુ ઝડપથી છુપાવી દે છે (આકૃતિ 7g–i). આમ, IPR કોષોનું વિભાજન પેટર્ન કોષોને ઇન્ટરનોડ્સની જેમ રેડિયલ પંક્તિઓમાં પૂર્વ-સંગઠિત કરે છે. રેડિયલ પંક્તિઓનું સંગઠન અને ક્રમિક અંગો વચ્ચે IPR કોષોનું સ્થાનિકીકરણ સૂચવે છે કે આ કોષો ઇન્ટરનોડલ પ્રોજેનિટર છે.
અહીં, અમે એક રેશિયોમેટ્રિક GA સિગ્નલિંગ બાયોસેન્સર, qmRGA વિકસાવ્યું છે, જે GA અને GA રીસેપ્ટર સાંદ્રતાના સંયુક્ત મેપિંગને મંજૂરી આપે છે જ્યારે એન્ડોજેનસ સિગ્નલિંગ માર્ગો સાથે દખલગીરી ઘટાડે છે, જેનાથી સેલ્યુલર સ્તરે GA કાર્ય વિશે માહિતી પૂરી પાડે છે. આ માટે, અમે એક સંશોધિત DELLA પ્રોટીન, mRGA બનાવ્યું છે, જેણે DELLA ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ભાગીદારોને બાંધવાની ક્ષમતા ગુમાવી દીધી છે પરંતુ GA-પ્રેરિત પ્રોટીઓલિસિસ પ્રત્યે સંવેદનશીલ રહે છે. qmRGA GA સ્તરોમાં બાહ્ય અને અંતર્જાત બંને ફેરફારોનો પ્રતિભાવ આપે છે, અને તેના ગતિશીલ સંવેદના ગુણધર્મો વિકાસ દરમિયાન GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિમાં અવકાશી-ટેમ્પોરલ ફેરફારોનું મૂલ્યાંકન સક્ષમ કરે છે. qmRGA પણ એક ખૂબ જ લવચીક સાધન છે કારણ કે તેને તેના અભિવ્યક્તિ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રમોટરને બદલીને (જો જરૂરી હોય તો) વિવિધ પેશીઓમાં અનુકૂલિત કરી શકાય છે, અને GA સિગ્નલિંગ માર્ગની સંરક્ષિત પ્રકૃતિ અને એન્જીયોસ્પર્મ્સમાં PFYRE મોટિફને જોતાં, તે અન્ય પ્રજાતિઓમાં ટ્રાન્સફર થઈ શકે તેવી શક્યતા છે. આ સાથે સુસંગત, ચોખાના SLR1 DELLA પ્રોટીન (HYY497AAA) માં સમકક્ષ પરિવર્તન પણ SLR1 ની વૃદ્ધિ દમનકારી પ્રવૃત્તિને દબાવવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું જ્યારે તેના GA-મધ્યસ્થી અધોગતિમાં થોડો ઘટાડો થયો હતો, જે mRGA23 ની જેમ હતો. નોંધનીય છે કે, Arabidopsis માં તાજેતરના અભ્યાસો દર્શાવે છે કે PFYRE ડોમેન (S474L) માં એક જ એમિનો એસિડ પરિવર્તને ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર ભાગીદારો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવાની તેની ક્ષમતાને અસર કર્યા વિના RGA ની ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રવૃત્તિમાં ફેરફાર કર્યો હતો. જોકે આ પરિવર્તન mRGA માં હાજર 3 એમિનો એસિડ અવેજીની ખૂબ નજીક છે, અમારા અભ્યાસો દર્શાવે છે કે આ બે પરિવર્તન DELLA ની વિશિષ્ટ લાક્ષણિકતાઓમાં ફેરફાર કરે છે. જોકે મોટાભાગના ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર ભાગીદારો DELLA26,51 ના LHR1 અને SAW ડોમેન સાથે જોડાય છે, PFYRE ડોમેનમાં કેટલાક સંરક્ષિત એમિનો એસિડ આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને સ્થિર કરવામાં મદદ કરી શકે છે.
ઇન્ટરનોડ વિકાસ એ છોડના સ્થાપત્ય અને ઉપજ સુધારણામાં એક મુખ્ય લક્ષણ છે. qmRGA એ IPR ઇન્ટરનોડ પ્રોજેનિટર કોષોમાં ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ જાહેર કરી. જથ્થાત્મક ઇમેજિંગ અને જિનેટિક્સને જોડીને, અમે બતાવ્યું કે GA સિગ્નલિંગ પેટર્ન SAM બાહ્ય ત્વચામાં ગોળાકાર/ટ્રાન્સવર્સ કોષ વિભાજન વિમાનોને સુપરઇમ્પોઝ કરે છે, જે ઇન્ટરનોડ વિકાસ માટે જરૂરી કોષ વિભાજન સંગઠનને આકાર આપે છે. વિકાસ દરમિયાન કોષ વિભાજન વિમાન ઓરિએન્ટેશનના ઘણા નિયમનકારો ઓળખવામાં આવ્યા છે52,53. અમારું કાર્ય GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિ આ સેલ્યુલર પરિમાણને કેવી રીતે નિયંત્રિત કરે છે તેનું સ્પષ્ટ ઉદાહરણ પૂરું પાડે છે. DELLA પ્રીફોલ્ડિંગ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ41 સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી શકે છે, તેથી GA સિગ્નલિંગ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઓરિએન્ટેશન40,41,54,55 ને સીધા પ્રભાવિત કરીને કોષ વિભાજન વિમાન ઓરિએન્ટેશનને નિયંત્રિત કરી શકે છે. અમે અણધારી રીતે બતાવ્યું કે SAM માં, ઉચ્ચ GA સિગ્નલિંગ પ્રવૃત્તિનો સહસંબંધ કોષ વિસ્તરણ અથવા વિભાજન નહોતો, પરંતુ ફક્ત વૃદ્ધિ એનિસોટ્રોપી હતો, જે IPR માં કોષ વિભાજનની દિશા પર GA ની સીધી અસર સાથે સુસંગત છે. જોકે, આપણે એ વાતને બાકાત રાખી શકતા નથી કે આ અસર પરોક્ષ પણ હોઈ શકે છે, ઉદાહરણ તરીકે GA-પ્રેરિત કોષ દિવાલ નરમાઈ દ્વારા મધ્યસ્થી56. કોષ દિવાલ ગુણધર્મોમાં ફેરફાર યાંત્રિક તાણને પ્રેરિત કરે છે57,58, જે કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના ઓરિએન્ટેશનને અસર કરીને કોષ વિભાજન સમતલના ઓરિએન્ટેશનને પણ પ્રભાવિત કરી શકે છે39,46,59. GA-પ્રેરિત યાંત્રિક તાણ અને GA દ્વારા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઓરિએન્ટેશનના સીધા નિયમનની સંયુક્ત અસરો ઇન્ટરનોડ્સને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે IPR માં કોષ વિભાજન ઓરિએન્ટેશનની ચોક્કસ પેટર્ન ઉત્પન્ન કરવામાં સામેલ હોઈ શકે છે, અને આ વિચારને ચકાસવા માટે વધુ અભ્યાસોની જરૂર છે. તેવી જ રીતે, અગાઉના અભ્યાસોએ ઇન્ટરનોડ રચનાના નિયંત્રણમાં DELLA-પરસ્પર ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા પ્રોટીન TCP14 અને 15 ના મહત્વ પર પ્રકાશ પાડ્યો છે60,61 અને આ પરિબળો GA ની ક્રિયાને BREVIPEDICELLUS (BP) અને PENNYWISE (PNY) સાથે મધ્યસ્થી કરી શકે છે, જે ઇન્ટરનોડ વિકાસને નિયંત્રિત કરે છે અને GA સિગ્નલિંગ2,62 ને પ્રભાવિત કરતા દર્શાવવામાં આવ્યા છે. DELLAs બ્રેસિનોસ્ટેરોઇડ, ઇથિલિન, જેસ્મોનિક એસિડ અને એબ્સિસિક એસિડ (ABA) સિગ્નલિંગ માર્ગો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે63,64 અને આ હોર્મોન્સ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઓરિએન્ટેશનને પ્રભાવિત કરી શકે છે65, કોષ વિભાજન ઓરિએન્ટેશન પર GA ની અસરો અન્ય હોર્મોન્સ દ્વારા પણ મધ્યસ્થી થઈ શકે છે.
પ્રારંભિક સાયટોલોજિકલ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે ઇન્ટરનોડ વિકાસ માટે એરેબિડોપ્સિસ SAM ના આંતરિક અને બાહ્ય બંને ક્ષેત્રો જરૂરી છે2,42. GA આંતરિક પેશીઓમાં કોષ વિભાજનને સક્રિય રીતે નિયંત્રિત કરે છે તે હકીકત SAM માં મેરિસ્ટેમ અને ઇન્ટરનોડ કદને નિયંત્રિત કરવામાં GA ના બેવડા કાર્યને સમર્થન આપે છે. આંતરિક SAM પેશીઓમાં દિશાત્મક કોષ વિભાજનની પેટર્ન પણ ચુસ્તપણે નિયંત્રિત થાય છે, અને આ નિયમન સ્ટેમ વૃદ્ધિ માટે આવશ્યક છે52. તે તપાસવું રસપ્રદ રહેશે કે GA આંતરિક SAM સંગઠનમાં કોષ વિભાજન સમતલને દિશામાન કરવામાં પણ ભૂમિકા ભજવે છે કે નહીં, જેનાથી SAM ની અંદર ઇન્ટરનોડ્સના સ્પષ્ટીકરણ અને વિકાસને સુમેળ કરવામાં આવે છે.
છોડને માટીમાં અથવા 1x મુરાશિગે-સ્કૂગ (MS) માધ્યમ (ડુચેફા) માં 1% સુક્રોઝ અને 1% અગર (સિગ્મા) સાથે પ્રમાણભૂત પરિસ્થિતિઓ (16 કલાક પ્રકાશ, 22 °C) હેઠળ ઉગાડવામાં આવ્યા હતા, સિવાય કે હાયપોકોટાઇલ અને મૂળ વૃદ્ધિ પ્રયોગો જેમાં રોપાઓ સતત પ્રકાશ અને 22 °C હેઠળ ઊભી પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. નાઈટ્રેટ પ્રયોગો માટે, છોડને લાંબા દિવસની પરિસ્થિતિઓમાં પૂરતા નાઈટ્રેટ (0 અથવા 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-સક્સીનેટ, 1% સુક્રોઝ અને 1% A-અગર (સિગ્મા) સાથે પૂરક રીતે સંશોધિત MS માધ્યમ (બાયોવર્લ્ડ પ્લાન્ટ માધ્યમ) પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા.
pDONR221 માં દાખલ કરાયેલ GID1a cDNA ને pDONR P4-P1R-pUBQ10 અને pDONR P2R-P3-mCherry સાથે pB7m34GW માં ફરીથી જોડવામાં આવ્યું જેથી pUBQ10::GID1a-mCherry ઉત્પન્ન થાય. pDONR221 માં દાખલ કરાયેલ IDD2 DNA ને p35S:IDD2-RFP ઉત્પન્ન થાય તે માટે pB7RWG266 માં ફરીથી જોડવામાં આવ્યું. pGID1b::2xmTQ2-GID1b જનરેટ કરવા માટે, GID1b કોડિંગ ક્ષેત્રના ઉપરના ભાગમાં 3.9 kb ટુકડા અને GID1b cDNA (1.3 kb) અને ટર્મિનેટર (3.4 kb) ધરાવતા 4.7 kb ટુકડાને પહેલા પૂરક કોષ્ટક 3 માં પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી અનુક્રમે pDONR P4-P1R (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) અને pDONR P2R-P3 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) માં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા, અને અંતે ગેટવે ક્લોનિંગનો ઉપયોગ કરીને pGreen 012567 લક્ષ્ય વેક્ટરમાં pDONR221 2xmTQ268 સાથે ફરીથી જોડવામાં આવ્યા હતા. pCUC2::LSSmOrange જનરેટ કરવા માટે, CUC2 પ્રમોટર સિક્વન્સ (ATG ના 3229 bp અપસ્ટ્રીમ) અને ત્યારબાદ N7 ન્યુક્લિયર લોકલાઇઝેશન સિગ્નલ અને NOS ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ટર્મિનેટર સાથે મોટા સ્ટોક્સ-શિફ્ટેડ mOrange (LSSmOrange)69 ના કોડિંગ સિક્વન્સને ગેટવે 3-ફ્રેગમેન્ટ રિકોમ્બિનેશન સિસ્ટમ (ઇનવિટ્રોજન) નો ઉપયોગ કરીને pગ્રીન કેનામિસિન ટાર્ગેટિંગ વેક્ટરમાં એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્લાન્ટ બાયનરી વેક્ટરને એગ્રોબેક્ટેરિયમ ટ્યુમેફેસિયન્સ સ્ટ્રેન GV3101 માં દાખલ કરવામાં આવ્યો હતો અને એગ્રોબેક્ટેરિયમ ઇન્ફલિશન પદ્ધતિ દ્વારા નિકોટિઆના બેન્થામિયાના પાંદડાઓમાં અને ફ્લોરલ ડિપ પદ્ધતિ દ્વારા એરેબિડોપ્સિસ થલિયાના કોલ-0 માં દાખલ કરવામાં આવ્યો હતો. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry અને pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ને અનુક્રમે સંબંધિત ક્રોસના F3 અને F1 પ્રોજેનીમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.
RNA ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશન આશરે 1 સેમી લાંબા શૂટ ટીપ્સ72 પર કરવામાં આવ્યું હતું, જે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને તરત જ FAA દ્રાવણ (3.7% ફોર્માલ્ડીહાઇડ, 5% એસિટિક એસિડ, 50% ઇથેનોલ) માં 4 °C સુધી પૂર્વ-ઠંડું કરવામાં આવ્યું હતું. 2 × 15 મિનિટ વેક્યુમ ટ્રીટમેન્ટ પછી, ફિક્સેટિવ બદલવામાં આવ્યું હતું અને નમૂનાઓને રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, અને RGL3 cDNAs અને તેમના 3′-UTRs માટે એન્ટિસેન્સ પ્રોબ્સને રોઝિયર એટ અલ.73 દ્વારા વર્ણવ્યા મુજબ પૂરક કોષ્ટક 3 માં દર્શાવેલ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા. ડિગોક્સિજેનિન-લેબલવાળા પ્રોબ્સને ડિગોક્સિજેનિન એન્ટિબોડીઝ (3000-ફોલ્ડ ડિલ્યુશન; રોશે, કેટલોગ નંબર: 11 093 274 910) નો ઉપયોગ કરીને રોગપ્રતિકારક શોધ કરવામાં આવી હતી, અને વિભાગોને 5-બ્રોમો-4-ક્લોરો-3-ઇન્ડોલિલ ફોસ્ફેટ (BCIP, 250-ફોલ્ડ ડિલ્યુશન)/નાઇટ્રોબ્લુ ટેટ્રાઝોલિયમ (NBT, 200-ફોલ્ડ ડિલ્યુશન) સોલ્યુશનથી સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા.