નાના જળચર ટેડપોલ્સ માટે વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિન તૈયારીઓનો મૃત્યુદર અને ઝેરીતા

આ અભ્યાસમાં વ્યાપારી ઘાતકતા, સૂક્ષ્મજીવ અને ઝેરીતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતુંસાયપરમેથ્રિનઅનુરાન ટેડપોલ્સ માટે ફોર્મ્યુલેશન. એક્યુટ ટેસ્ટમાં, 96 કલાક માટે 100-800 μg/L ની સાંદ્રતાનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. ક્રોનિક ટેસ્ટમાં, કુદરતી રીતે બનતી સાયપરમેથ્રિન સાંદ્રતા (1, 3, 6, અને 20 μg/L) મૃત્યુદર માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ માઇક્રોન્યુક્લિયસ પરીક્ષણ અને 7 દિવસ માટે લાલ રક્તકણો પરમાણુ અસામાન્યતાઓ કરવામાં આવી. ટેડપોલ્સ માટે વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિન ફોર્મ્યુલેશનનું LC50 273.41 μg L−1 હતું. ક્રોનિક ટેસ્ટમાં, સૌથી વધુ સાંદ્રતા (20 μg L−1) 50% થી વધુ મૃત્યુદરમાં પરિણમી, કારણ કે તેણે પરીક્ષણ કરાયેલા અડધા ટેડપોલ્સને મારી નાખ્યા. માઇક્રોન્યુક્લિયસ ટેસ્ટમાં 6 અને 20 μg L−1 પર નોંધપાત્ર પરિણામો દર્શાવવામાં આવ્યા અને ઘણી પરમાણુ અસામાન્યતાઓ મળી આવી, જે દર્શાવે છે કે વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિન ફોર્મ્યુલેશનમાં P. gracilis સામે જીનોટોક્સિક ક્ષમતા છે. આ પ્રજાતિ માટે સાયપરમેથ્રિન એક ઉચ્ચ જોખમ છે, જે દર્શાવે છે કે તે બહુવિધ સમસ્યાઓનું કારણ બની શકે છે અને ટૂંકા અને લાંબા ગાળે આ ઇકોસિસ્ટમની ગતિશીલતાને અસર કરી શકે છે. તેથી, એવું નિષ્કર્ષ પર આવી શકે છે કે વ્યાપારી સાયપરમેથ્રિન ફોર્મ્યુલેશન પી. ગ્રેસિલિસ પર ઝેરી અસરો ધરાવે છે.
કૃષિ પ્રવૃત્તિઓના સતત વિસ્તરણ અને સઘન ઉપયોગને કારણેજીવાત નિયંત્રણપગલાં, જળચર પ્રાણીઓ વારંવાર જંતુનાશકોના સંપર્કમાં આવે છે1,2. કૃષિ ક્ષેત્રોની નજીકના જળ સંસાધનોનું પ્રદૂષણ ઉભયજીવી પ્રાણીઓ જેવા બિન-લક્ષ્ય જીવોના વિકાસ અને અસ્તિત્વને અસર કરી શકે છે.
પર્યાવરણીય મેટ્રિક્સના મૂલ્યાંકનમાં ઉભયજીવી પ્રાણીઓ વધુને વધુ મહત્વપૂર્ણ બની રહ્યા છે. જટિલ જીવન ચક્ર, ઝડપી લાર્વા વૃદ્ધિ દર, ટ્રોફિક સ્થિતિ, પારગમ્ય ત્વચા10,11, પ્રજનન માટે પાણી પર નિર્ભરતા12 અને અસુરક્ષિત ઇંડા11,13,14 જેવી તેમની અનન્ય લાક્ષણિકતાઓને કારણે અનુરાન્સને પર્યાવરણીય પ્રદૂષકોના સારા જૈવ સૂચક માનવામાં આવે છે. નાના પાણીના દેડકા (ફિઝાલેમસ ગ્રેસિલિસ), જેને સામાન્ય રીતે રડતા દેડકા તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, તેને જંતુનાશક પ્રદૂષણ4,5,6,7,15 ની જૈવ સૂચક પ્રજાતિ તરીકે દર્શાવવામાં આવી છે. આ પ્રજાતિ આર્જેન્ટિના, ઉરુગ્વે, પેરાગ્વે અને બ્રાઝિલમાં સ્થિર પાણી, સંરક્ષિત વિસ્તારો અથવા પરિવર્તનશીલ રહેઠાણવાળા વિસ્તારોમાં જોવા મળે છે1617 અને IUCN વર્ગીકરણ દ્વારા તેના વ્યાપક વિતરણ અને વિવિધ રહેઠાણો18 ની સહનશીલતાને કારણે તેને સ્થિર માનવામાં આવે છે.
સાયપરમેથ્રિનના સંપર્કમાં આવ્યા પછી ઉભયજીવી પ્રાણીઓમાં સબલેથલ અસરો નોંધાઈ છે, જેમાં ટેડપોલ્સમાં વર્તણૂકીય, મોર્ફોલોજિકલ અને બાયોકેમિકલ ફેરફારો 23,24,25, મૃત્યુદર અને મેટામોર્ફોસિસ સમય, એન્ઝાઇમેટિક ફેરફારો, ઇંડામાંથી બહાર નીકળવાની સફળતામાં ઘટાડો 24,25, હાયપરએક્ટિવિટી 26, કોલિનેસ્ટેરેઝ પ્રવૃત્તિમાં અવરોધ 27 અને સ્વિમિંગ પ્રદર્શનમાં ફેરફાર 7,28નો સમાવેશ થાય છે. જો કે, ઉભયજીવી પ્રાણીઓમાં સાયપરમેથ્રિનની જીનોટોક્સિક અસરોના અભ્યાસ મર્યાદિત છે. તેથી, સાયપરમેથ્રિન પ્રત્યે અનુરાન પ્રજાતિઓની સંવેદનશીલતાનું મૂલ્યાંકન કરવું મહત્વપૂર્ણ છે.
પર્યાવરણીય પ્રદૂષણ ઉભયજીવી પ્રાણીઓના સામાન્ય વિકાસ અને વિકાસને અસર કરે છે, પરંતુ સૌથી ગંભીર પ્રતિકૂળ અસર જંતુનાશકોના સંપર્કને કારણે ડીએનએને થતા આનુવંશિક નુકસાન છે13. રક્ત કોષ મોર્ફોલોજી વિશ્લેષણ એ પ્રદૂષણ અને જંગલી પ્રજાતિઓ માટે પદાર્થની સંભવિત ઝેરીતાનું એક મહત્વપૂર્ણ જૈવ સૂચક છે29. માઇક્રોન્યુક્લિયસ પરીક્ષણ એ પર્યાવરણમાં રસાયણોની જીનોટોક્સિસિટી નક્કી કરવા માટે સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિઓમાંની એક છે30. તે એક ઝડપી, અસરકારક અને સસ્તી પદ્ધતિ છે જે ઉભયજીવી પ્રાણીઓ જેવા સજીવોના રાસાયણિક પ્રદૂષણનું સારું સૂચક છે31,32 અને જીનોટોક્સિક પ્રદૂષકોના સંપર્ક વિશે માહિતી પ્રદાન કરી શકે છે33.
આ અભ્યાસનો ઉદ્દેશ માઇક્રોન્યુક્લિયસ પરીક્ષણ અને ઇકોલોજીકલ જોખમ મૂલ્યાંકનનો ઉપયોગ કરીને નાના જળચર ટેડપોલ્સમાં વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિન ફોર્મ્યુલેશનની ઝેરી સંભાવનાનું મૂલ્યાંકન કરવાનો હતો.
પરીક્ષણના તીવ્ર સમયગાળા દરમિયાન વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિનની વિવિધ સાંદ્રતાના સંપર્કમાં આવેલા પી. ગ્રેસિલિસ ટેડપોલ્સનો સંચિત મૃત્યુદર (%).
ક્રોનિક પરીક્ષણ દરમિયાન વાણિજ્યિક સાયપરમેથ્રિનની વિવિધ સાંદ્રતાના સંપર્કમાં આવતા પી. ગ્રેસિલિસ ટેડપોલ્સની સંચિત મૃત્યુદર (%).
સાયપરમેથ્રિનની વિવિધ સાંદ્રતા (6 અને 20 μg/L) ના સંપર્કમાં આવેલા ઉભયજીવી પ્રાણીઓમાં જીનોટોક્સિક અસરોનું પરિણામ જોવા મળ્યું હતું, જે માઇક્રોન્યુક્લી (MN) ની હાજરી અને લાલ રક્તકણોમાં પરમાણુ અસામાન્યતાઓ દ્વારા પુરાવા મળે છે. MN ની રચના મિટોસિસમાં ભૂલો સૂચવે છે અને તે રંગસૂત્રોના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સાથે નબળા બંધન, રંગસૂત્ર શોષણ અને પરિવહન માટે જવાબદાર પ્રોટીન સંકુલમાં ખામીઓ, રંગસૂત્ર અલગતામાં ભૂલો અને DNA નુકસાન સમારકામમાં ભૂલો સાથે સંકળાયેલ છે38,39 અને જંતુનાશક-પ્રેરિત ઓક્સિડેટીવ તણાવ40,41 સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે. મૂલ્યાંકન કરાયેલી બધી સાંદ્રતાઓમાં અન્ય અસામાન્યતાઓ જોવા મળી હતી. સાયપરમેથ્રિનની સાંદ્રતામાં વધારો થવાથી લાલ રક્તકણોમાં પરમાણુ અસામાન્યતાઓમાં અનુક્રમે સૌથી ઓછા (1 μg/L) અને સૌથી વધુ (20 μg/L) ડોઝ પર 5% અને 20% નો વધારો થયો છે. ઉદાહરણ તરીકે, પ્રજાતિના DNAમાં ફેરફાર ટૂંકા અને લાંબા ગાળાના અસ્તિત્વ માટે ગંભીર પરિણામો લાવી શકે છે, જેના પરિણામે વસ્તીમાં ઘટાડો, પ્રજનન યોગ્યતામાં ફેરફાર, સંવર્ધન, આનુવંશિક વિવિધતામાં ઘટાડો અને સ્થળાંતર દરમાં ફેરફાર થાય છે. આ બધા પરિબળો પ્રજાતિઓના અસ્તિત્વ અને જાળવણીને અસર કરી શકે છે42,43. એરિથ્રોઇડ અસામાન્યતાઓનું નિર્માણ સાયટોકાઇનેસિસમાં અવરોધ સૂચવી શકે છે, જેના પરિણામે અસામાન્ય કોષ વિભાજન (બાયન્યુક્લિયેટેડ એરિથ્રોસાઇટ્સ)44,45 થાય છે; મલ્ટિલોબ્ડ ન્યુક્લી એ બહુવિધ લોબ્સ સાથે ન્યુક્લિયર મેમ્બ્રેનના પ્રોટ્રુઝન છે46, જ્યારે અન્ય એરિથ્રોઇડ અસામાન્યતાઓ ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે, જેમ કે ન્યુક્લિયર કિડની/બ્લેબ્સ47. એન્યુક્લિયેટેડ એરિથ્રોસાઇટ્સની હાજરી ક્ષતિગ્રસ્ત ઓક્સિજન પરિવહન સૂચવી શકે છે, ખાસ કરીને દૂષિત પાણીમાં48,49. એપોપ્ટોસિસ કોષ મૃત્યુ50 સૂચવે છે.
અન્ય અભ્યાસોએ પણ સાયપરમેથ્રિનની જીનોટોક્સિક અસરો દર્શાવી છે. કબાના એટ અલ.51 એ 96 કલાક માટે સાયપરમેથ્રિન (5000 અને 10,000 μg L−1) ની ઉચ્ચ સાંદ્રતાના સંપર્કમાં આવ્યા પછી ઓડોન્ટોફ્રાયનસ અમેરિકનસ કોષોમાં માઇક્રોન્યુક્લી અને બાયન્યુક્લીએટેડ કોષો અને એપોપ્ટોટિક કોષો જેવા પરમાણુ ફેરફારોની હાજરી દર્શાવી હતી. P. biligonigerus52 અને Rhinella arenarum53 માં પણ સાયપરમેથ્રિન-પ્રેરિત એપોપ્ટોસિસ શોધી કાઢવામાં આવ્યો હતો. આ પરિણામો સૂચવે છે કે સાયપરમેથ્રિન વિવિધ જળચર જીવો પર જીનોટોક્સિક અસરો ધરાવે છે અને MN અને ENA પરીક્ષણ ઉભયજીવી પ્રાણીઓ પર સબલેથલ અસરોનું સૂચક હોઈ શકે છે અને ઝેરી પદાર્થોના સંપર્કમાં આવતા મૂળ પ્રજાતિઓ અને જંગલી વસ્તીને લાગુ પડી શકે છે.
સાયપરમેથ્રિનના વાણિજ્યિક ફોર્મ્યુલેશન્સ ઉચ્ચ પર્યાવરણીય જોખમ (એક્યુટ અને ક્રોનિક બંને) ઊભું કરે છે, જેમાં મુખ્ય મથક યુએસ એન્વાયર્નમેન્ટલ પ્રોટેક્શન એજન્સી (EPA) સ્તર 54 કરતાં વધી જાય છે જે પર્યાવરણમાં હાજર હોય તો પ્રજાતિઓને પ્રતિકૂળ અસર કરી શકે છે. ક્રોનિક જોખમ મૂલ્યાંકનમાં, મૃત્યુદર માટે NOEC 3 μg L−1 હતું, જે પુષ્ટિ કરે છે કે પાણીમાં જોવા મળતી સાંદ્રતા પ્રજાતિઓ માટે જોખમ ઊભું કરી શકે છે55. એન્ડોસલ્ફાન અને સાયપરમેથ્રિનના મિશ્રણના સંપર્કમાં આવતા R. એરેનાર્મ લાર્વા માટે ઘાતક NOEC 168 કલાક પછી 500 μg L−1 હતું; આ મૂલ્ય 336 કલાક પછી ઘટીને 0.0005 μg L−1 થઈ ગયું. લેખકો દર્શાવે છે કે સંપર્ક જેટલો લાંબો રહેશે, પ્રજાતિઓ માટે હાનિકારક સાંદ્રતા ઓછી થશે. એ પણ પ્રકાશિત કરવું મહત્વપૂર્ણ છે કે NOEC મૂલ્યો સમાન સંપર્ક સમયે P. ગ્રેસિલિસ કરતા વધારે હતા, જે દર્શાવે છે કે સાયપરમેથ્રિન પ્રત્યે પ્રજાતિઓનો પ્રતિભાવ પ્રજાતિ-વિશિષ્ટ છે. વધુમાં, મૃત્યુદરની દ્રષ્ટિએ, સાયપરમેથ્રિનના સંપર્કમાં આવ્યા પછી P. ગ્રેસિલિસનું CHQ મૂલ્ય 64.67 પર પહોંચ્યું, જે યુએસ પર્યાવરણીય સુરક્ષા એજન્સી54 દ્વારા નિર્ધારિત સંદર્ભ મૂલ્ય કરતા વધારે છે, અને R. એરેનાર્મ લાર્વાનું CHQ મૂલ્ય પણ આ મૂલ્ય કરતા વધારે હતું (CHQ > 388.00 336 કલાક પછી), જે દર્શાવે છે કે અભ્યાસ કરાયેલ જંતુનાશકો ઘણી ઉભયજીવી પ્રજાતિઓ માટે ઉચ્ચ જોખમ ઊભું કરે છે. P. ગ્રેસિલિસને મેટામોર્ફોસિસ પૂર્ણ કરવા માટે આશરે 30 દિવસની જરૂર પડે છે તે ધ્યાનમાં લેતા, એવું નિષ્કર્ષ પર આવી શકે છે કે સાયપરમેથ્રિનની અભ્યાસ કરાયેલ સાંદ્રતા ચેપગ્રસ્ત વ્યક્તિઓને નાની ઉંમરે પુખ્ત અથવા પ્રજનન તબક્કામાં પ્રવેશતા અટકાવીને વસ્તી ઘટાડામાં ફાળો આપી શકે છે.
માઇક્રોન્યુક્લી અને અન્ય એરિથ્રોસાઇટ ન્યુક્લિયર અસામાન્યતાઓના ગણતરી કરેલ જોખમ મૂલ્યાંકનમાં, CHQ મૂલ્યો 14.92 થી 97.00 સુધીના હતા, જે દર્શાવે છે કે સાયપરમેથ્રિન તેના કુદરતી નિવાસસ્થાનમાં પણ P. ગ્રેસિલિસ માટે સંભવિત જીનોટોક્સિક જોખમ ધરાવે છે. મૃત્યુદરને ધ્યાનમાં લેતા, P. ગ્રેસિલિસ માટે સહન કરી શકાય તેવા ઝેનોબાયોટિક સંયોજનોની મહત્તમ સાંદ્રતા 4.24 μg L−1 હતી. જો કે, 1 μg/L જેટલી ઓછી સાંદ્રતાએ પણ જીનોટોક્સિક અસરો દર્શાવી હતી. આ હકીકત અસામાન્ય વ્યક્તિઓની સંખ્યામાં વધારો કરી શકે છે57 અને તેમના નિવાસસ્થાનમાં પ્રજાતિઓના વિકાસ અને પ્રજનનને અસર કરી શકે છે, જેના કારણે ઉભયજીવી વસ્તીમાં ઘટાડો થઈ શકે છે.
જંતુનાશક સાયપરમેથ્રિનના વાણિજ્યિક ફોર્મ્યુલેશનમાં પી. ગ્રેસિલિસ માટે ઉચ્ચ તીવ્ર અને ક્રોનિક ઝેરીતા જોવા મળી હતી. માઇક્રોન્યુક્લી અને એરિથ્રોસાઇટ ન્યુક્લિયર અસામાન્યતાઓ, ખાસ કરીને સેરેટેડ ન્યુક્લી, લોબ્ડ ન્યુક્લી અને વેસિક્યુલર ન્યુક્લીની હાજરી દ્વારા પુરાવા મળ્યા મુજબ, ઝેરી અસરોને કારણે ઉચ્ચ મૃત્યુદર જોવા મળ્યો હતો. વધુમાં, અભ્યાસ કરાયેલ પ્રજાતિઓએ તીવ્ર અને ક્રોનિક બંને પ્રકારના પર્યાવરણીય જોખમોમાં વધારો દર્શાવ્યો હતો. અમારા સંશોધન જૂથ દ્વારા અગાઉના અભ્યાસો સાથે જોડાયેલા આ ડેટા દર્શાવે છે કે સાયપરમેથ્રિનના વિવિધ વાણિજ્યિક ફોર્મ્યુલેશન પણ એસિટિલકોલિનેસ્ટેરેઝ (AChE) અને બ્યુટીરીલકોલિનેસ્ટેરેઝ (BChE) પ્રવૃત્તિઓ અને ઓક્સિડેટીવ તણાવમાં ઘટાડો58 નું કારણ બને છે, અને પી. ગ્રેસિલિસમાં સ્વિમિંગ પ્રવૃત્તિ અને મૌખિક ખોડખાંપણ59 માં ફેરફાર તરફ દોરી જાય છે, જે દર્શાવે છે કે સાયપરમેથ્રિનના વાણિજ્યિક ફોર્મ્યુલેશનમાં આ પ્રજાતિ માટે ઉચ્ચ ઘાતક અને સબલેથલ ઝેરીતા છે. હાર્ટમેન એટ અલ. 60 એ શોધી કાઢ્યું કે સાયપરમેથ્રિનના વાણિજ્યિક ફોર્મ્યુલેશન પી. ગ્રેસિલિસ અને તે જ જાતિની બીજી પ્રજાતિ (P. cuvieri) માટે નવ અન્ય જંતુનાશકોની તુલનામાં સૌથી વધુ ઝેરી હતા. આ સૂચવે છે કે પર્યાવરણીય સંરક્ષણ માટે સાયપરમેથ્રિનની કાયદેસર રીતે મંજૂર સાંદ્રતા ઉચ્ચ મૃત્યુદર અને લાંબા ગાળાની વસ્તી ઘટાડામાં પરિણમી શકે છે.
ઉભયજીવી પ્રાણીઓ માટે જંતુનાશકની ઝેરી અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે, કારણ કે પર્યાવરણમાં જોવા મળતી સાંદ્રતા ઉચ્ચ મૃત્યુદરનું કારણ બની શકે છે અને પી. ગ્રેસિલિસ માટે સંભવિત જોખમ ઊભું કરી શકે છે. ઉભયજીવી પ્રજાતિઓ પર સંશોધનને પ્રોત્સાહન આપવું જોઈએ, કારણ કે આ જીવો પર ડેટા દુર્લભ છે, ખાસ કરીને બ્રાઝિલિયન પ્રજાતિઓ પર.
સ્થિર પરિસ્થિતિઓમાં ક્રોનિક ટોક્સિસિટી ટેસ્ટ 168 કલાક (7 દિવસ) સુધી ચાલ્યો અને સબલેથલ સાંદ્રતા 1, 3, 6 અને 20 μg ai L−1 હતી. બંને પ્રયોગોમાં, પ્રતિ સારવાર જૂથ 10 ટેડપોલ્સનું મૂલ્યાંકન છ પ્રતિકૃતિઓ સાથે કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં પ્રતિ સાંદ્રતા કુલ 60 ટેડપોલ્સ હતા. દરમિયાન, ફક્ત પાણી-માત્ર સારવાર નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે સેવા આપી હતી. દરેક પ્રાયોગિક સેટઅપમાં 500 મિલીની ક્ષમતા અને 50 મિલી દ્રાવણ દીઠ 1 ટેડપોલની ઘનતા ધરાવતી જંતુરહિત કાચની વાનગીનો સમાવેશ થતો હતો. બાષ્પીભવન અટકાવવા માટે ફ્લાસ્કને પોલિઇથિલિન ફિલ્મથી ઢાંકવામાં આવ્યો હતો અને સતત વાયુયુક્ત કરવામાં આવતો હતો.
0, 96 અને 168 કલાક પર જંતુનાશકોની સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે પાણીનું રાસાયણિક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. સબિન એટ અલ. 68 અને માર્ટિન્સ એટ અલ. 69 અનુસાર, ફેડરલ યુનિવર્સિટી ઓફ સાન્ટા મારિયાની જંતુનાશક વિશ્લેષણ પ્રયોગશાળા (LARP) ખાતે ટ્રિપલ ક્વાડ્રુપોલ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (વેરિયન મોડેલ 1200, પાલો અલ્ટો, કેલિફોર્નિયા, યુએસએ) સાથે જોડાયેલ ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફીનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પાણીમાં જંતુનાશકોનું માત્રાત્મક નિર્ધારણ પૂરક સામગ્રી તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું છે (કોષ્ટક SM1).
માઇક્રોન્યુક્લિયસ ટેસ્ટ (MNT) અને રેડ સેલ ન્યુક્લિયર એબનોર્મલિટી ટેસ્ટ (RNA) માટે, દરેક ટ્રીટમેન્ટ ગ્રુપમાંથી 15 ટેડપોલ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. ટેડપોલ્સને 5% લિડોકેઇન (50 મિલિગ્રામ g-170) વડે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા અને ડિસ્પોઝેબલ હેપરિનાઇઝ્ડ સિરીંજનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક પંચર દ્વારા લોહીના નમૂના લેવામાં આવ્યા. બ્લડ સ્મીયર્સને જંતુરહિત માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડ્સ પર તૈયાર કરવામાં આવ્યા, હવામાં સૂકવવામાં આવ્યા, 100% મિથેનોલ (4 °C) સાથે 2 મિનિટ માટે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા, અને પછી અંધારામાં 15 મિનિટ માટે 10% ગિએમ્સા સોલ્યુશનથી સ્ટેન કરવામાં આવ્યા. પ્રક્રિયાના અંતે, સ્લાઇડ્સને વધારાના ડાઘ દૂર કરવા માટે નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવામાં આવ્યા અને ઓરડાના તાપમાને સૂકવવામાં આવ્યા.
MN અને ENA ની હાજરી નક્કી કરવા માટે 71 ઉદ્દેશ્ય સાથે 100× માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને દરેક ટેડપોલમાંથી ઓછામાં ઓછા 1000 આરબીસીનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. સાયપરમેથ્રિન સાંદ્રતા અને નિયંત્રણોને ધ્યાનમાં રાખીને ટેડપોલમાંથી કુલ 75,796 આરબીસીનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. કેરાસ્કો એટ અલ. અને ફેનેચ એટ અલ.38,72 ની પદ્ધતિ અનુસાર જીનોટોક્સિસિટીનું વિશ્લેષણ નીચેના પરમાણુ જખમોની આવર્તન નક્કી કરીને કરવામાં આવ્યું હતું: (1) એન્યુક્લીએટ કોષો: ન્યુક્લી વગરના કોષો; (2) એપોપ્ટોટિક કોષો: ન્યુક્લી ફ્રેગમેન્ટેશન, પ્રોગ્રામ્ડ કોષ મૃત્યુ; (3) બાયન્યુક્લીએટ કોષો: બે ન્યુક્લીવાળા કોષો; (4) ન્યુક્લીયર બડ્સ અથવા બ્લેબ કોષો: ન્યુક્લીયર મેમ્બ્રેનના નાના પ્રોટ્રુઝનવાળા ન્યુક્લીવાળા કોષો, માઇક્રોન્યુક્લી જેવા કદના બ્લેબ્સ; (5) કેરીઓલાઇઝ્ડ કોષો: આંતરિક સામગ્રી વિના ન્યુક્લીયરની રૂપરેખા ધરાવતા કોષો; (6) ખાંચવાળા કોષો: સ્પષ્ટ તિરાડો અથવા ખાંચો ધરાવતા ન્યુક્લીવાળા કોષો, જેને કિડની આકારનું ન્યુક્લી પણ કહેવાય છે; (૭) લોબ્યુલેટેડ કોષો: ઉપરોક્ત વેસિકલ્સ કરતા મોટા ન્યુક્લિયર પ્રોટ્રુઝન ધરાવતા કોષો; અને (૮) સૂક્ષ્મ કોષો: કન્ડેન્સ્ડ ન્યુક્લી અને ઘટાડેલા સાયટોપ્લાઝમ ધરાવતા કોષો. ફેરફારોની તુલના નકારાત્મક નિયંત્રણ પરિણામો સાથે કરવામાં આવી.
GBasic સોફ્ટવેર અને TSK-ટ્રીમ્ડ સ્પીયરમેન-કાર્બર પદ્ધતિ74 નો ઉપયોગ કરીને તીવ્ર ઝેરીતા પરીક્ષણ પરિણામો (LC50) નું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ક્રોનિક પરીક્ષણ ડેટાનું ભૂલ સામાન્યતા (શાપિરો-વિલ્ક્સ) અને ભિન્નતાની એકરૂપતા (બાર્ટલેટ) માટે પૂર્વ-પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પરિણામોનું વિશ્લેષણ એક-માર્ગી ભિન્નતા વિશ્લેષણ (ANOVA) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ટુકીના પરીક્ષણનો ઉપયોગ એકબીજા સાથે ડેટાની તુલના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, અને ડનેટના પરીક્ષણનો ઉપયોગ સારવાર જૂથ અને નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ વચ્ચે ડેટાની તુલના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
LOEC અને NOEC ડેટાનું વિશ્લેષણ ડનેટના પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. સ્ટેટિસ્ટિકા 8.0 સોફ્ટવેર (સ્ટેટસોફ્ટ) નો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય પરીક્ષણો 95% (p < 0.05) ના મહત્વ સ્તર સાથે કરવામાં આવ્યા હતા.