MAMP-ઉત્પાદિત સંરક્ષણ પ્રતિભાવની શક્તિ અને જુવારમાં પાંદડાની નિશાની માટે પ્રતિકારનું જિનોમ-વ્યાપી જોડાણ વિશ્લેષણ

છોડ અને રોગકારક સામગ્રી

જુવાર એસોસિએશન મેપિંગ વસ્તી જે જુવાર કન્વર્ઝન પોપ્યુલેશન (SCP) તરીકે ઓળખાય છે તે ડો. પેટ બ્રાઉન દ્વારા યુનિવર્સિટી ઓફ ઇલિનોઇસ (હવે યુસી ડેવિસ ખાતે) દ્વારા પ્રદાન કરવામાં આવી હતી.તે અગાઉ વર્ણવવામાં આવ્યું છે અને યુએસ વાતાવરણમાં છોડના વિકાસ અને વિકાસને સરળ બનાવવા માટે ફોટોપીરિયડ-સંવેદનશીલતા અને નાના કદમાં રૂપાંતરિત વિવિધ રેખાઓનો સંગ્રહ છે.આ અભ્યાસમાં આ વસ્તીમાંથી 510 રેખાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જોકે ખરાબ અંકુરણ અને અન્ય ગુણવત્તા નિયંત્રણ મુદ્દાઓને કારણે, ત્રણેય લક્ષણોના વિશ્લેષણમાં તમામ રેખાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો.આખરે 345 રેખાઓમાંથી ડેટાનો ઉપયોગ ચિટિન પ્રતિભાવના વિશ્લેષણ માટે, 472 લાઇનનો flg22 પ્રતિભાવ માટે અને 456 TLS પ્રતિકાર માટે કરવામાં આવ્યો હતો.B. કૂકીતાણ LSLP18 યુનિવર્સિટી ઓફ અરકાનસાસ ખાતે ડૉ. બર્ટ બ્લુહમ પાસેથી મેળવવામાં આવ્યું હતું.

MAMP પ્રતિભાવ માપન

આ અભ્યાસમાં બે અલગ-અલગ MAMP નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો flg22, (જેનસ્ક્રિપ્ટ કેટલોગ# RP19986), અને ચિટિન.જુવારના છોડને ગ્રીનહાઉસમાં માટીથી ભરેલા ફ્લેટ (33% સનશાઇન રેડી-અર્થ પ્રો ગ્રોઇંગ મિક્સ) પર નાખવામાં આવેલા ઇન્સર્ટ્સમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા.સંગ્રહના દિવસે પાંદડાની વધારાની ભેજ ટાળવા માટે નમૂનાના સંગ્રહના આગલા દિવસે છોડને પાણી આપવામાં આવ્યું હતું.

લીટીઓ રેન્ડમાઈઝ કરવામાં આવી હતી અને, લોજીસ્ટીકલ કારણોસર, 60 લીટીઓના બેચમાં રોપવામાં આવી હતી.પ્રત્યેક લીટી માટે, ત્રણ 'પોટ્સ' રોપવામાં આવ્યા હતા જેમાં પ્રતિ લીટી બે બીજ હતા.સમગ્ર વસ્તીનું મૂલ્યાંકન કરવામાં ન આવે ત્યાં સુધી અગાઉના બેચની પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હોય તેમ અનુગામી બેચનું વાવેતર કરવામાં આવ્યું હતું.બંને MAMP માટે બે પ્રાયોગિક રન હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા જેમાં દરેક બે રનમાં જીનોટાઇપ ફરીથી રેન્ડમાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા.

અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ આરઓએસ એસેસ હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.સંક્ષિપ્તમાં, દરેક લાઇન માટે, છ બીજ 3 જુદા જુદા પોટ્સમાં વાવવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી રોપાઓમાંથી, એકરૂપતાના આધારે ત્રણ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.જે રોપાઓ અસામાન્ય દેખાતા હતા અથવા બહુમતી કરતા નોંધપાત્ર રીતે ઊંચા કે ટૂંકા હતા તેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો.ત્રણ અલગ-અલગ 15-દિવસ જૂના જુવારના છોડના ચોથા પાંદડાના સૌથી પહોળા ભાગમાંથી 3 મીમી વ્યાસની ચાર લીફ ડિસ્ક એક્સાઇઝ કરવામાં આવી હતી.બે છોડમાંથી પર્ણ દીઠ એક ડિસ્ક અને એક છોડમાંથી બે ડિસ્ક, બીજી ડિસ્ક પાણીનું નિયંત્રણ બને છે (નીચે જુઓ).ડિસ્કને કાળી 96-વેલ પ્લેટમાં 50 µl H20 પર વ્યક્તિગત રીતે તરતી મૂકવામાં આવી હતી, જે પ્રકાશના સંપર્કમાં ન આવે તે માટે એલ્યુમિનિયમની સીલ વડે સીલ કરવામાં આવી હતી અને રાતોરાત ઓરડાના તાપમાને રાખવામાં આવી હતી.બીજા દિવસે સવારે 2 mg/ml કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ પ્રોબ L-012 (Wako, catalog # 120-04891), 2 mg/ml horseradish peroxidase (Type VI-A, Sigma-Aldrich, catalog # P6782) નો ઉપયોગ કરીને પ્રતિક્રિયા ઉકેલ બનાવવામાં આવ્યો. 100 mg/ml Chitin અથવા Flg22 નું 2 μM.આ પ્રતિક્રિયા દ્રાવણના 50 µl ચારમાંથી ત્રણ કૂવામાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.ચોથો કૂવો મોક કંટ્રોલ હતો, જેમાં MAMP ને બાદ કરતા પ્રતિક્રિયા ઉકેલ ઉમેરવામાં આવ્યો હતો.દરેક થાળીમાં માત્ર પાણી ધરાવતા ચાર કોરા કૂવાઓ પણ સામેલ હતા.

પ્રતિક્રિયા ઉકેલ ઉમેર્યા પછી, 1 કલાક માટે દર 2 મિનિટે SynergyTM 2 મલ્ટિ-ડિટેક્શન માઇક્રોપ્લેટ રીડર (બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને લ્યુમિનેસેન્સ માપવામાં આવ્યું હતું.પ્લેટ રીડર આ 1 કલાક દરમિયાન દર 2 મિનિટે લ્યુમિનેસેન્સ માપ લે છે.દરેક કૂવા માટે મૂલ્ય આપવા માટે તમામ 31 રીડિંગ્સના સરવાળાની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.દરેક જીનોટાઇપ માટે MAMP પ્રતિભાવ માટે અંદાજિત મૂલ્યની ગણતરી કરવામાં આવી હતી (ત્રણ પ્રાયોગિક કુવાઓનું સરેરાશ લ્યુમિનેસેન્સ મૂલ્ય-મોક વેલ મૂલ્ય) -સરેરાશ ખાલી કૂવા મૂલ્ય ઓછા.ખાલી કૂવાના મૂલ્યો સતત શૂન્યની નજીક હતા.

ની લીફ ડિસ્કનિકોટિઆના બેન્થામિઆના, ગુણવત્તા નિયંત્રણ હેતુઓ માટે દરેક 96-વેલ પ્લેટમાં નિયંત્રણો તરીકે એક ઉચ્ચ પ્રતિભાવશીલ જુવાર લાઇન (SC0003), અને એક ઓછી પ્રતિભાવશીલ જુવાર લાઇન (PI 6069)નો પણ સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો.

B. કૂકીઇનોક્યુલમ તૈયારી અને ઇનોક્યુલેશન

B. કૂકીઇનોક્યુલમ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું.સંક્ષિપ્તમાં, જુવારના દાણાને ત્રણ દિવસ સુધી પાણીમાં પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા, કોગળા કરવામાં આવ્યા હતા, 1L શંક્વાકાર ફ્લાસ્કમાં સ્કૂપ કરવામાં આવ્યા હતા અને 15psi અને 121 °C તાપમાને એક કલાક માટે ઓટોક્લેવ કરવામાં આવ્યા હતા.ત્યારબાદ અનાજને તાજી સંસ્કૃતિમાંથી લગભગ 5 મિલી મેસેરેટેડ માયસેલિયા સાથે ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું.B. કૂકીLSLP18 અલગ પાડે છે અને ઓરડાના તાપમાને 2 અઠવાડિયા માટે છોડી દે છે, ફ્લાસ્કને દર 3 દિવસે હલાવીને.2 અઠવાડિયા પછી, ફૂગથી પ્રભાવિત જુવારના અનાજને હવામાં સૂકવવામાં આવે છે અને પછી ખેતરમાં ઇનોક્યુલેશન સુધી 4 °C તાપમાને સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે.સમગ્ર અજમાયશ માટે સમાન ઇનોક્યુલમનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને દર વર્ષે તાજું કરવામાં આવ્યું હતું.ઇનોક્યુલેશન માટે, 4-5 અઠવાડિયા જૂના જુવારના છોડમાં 6-10 ચેપગ્રસ્ત અનાજ મૂકવામાં આવ્યા હતા.આ ફૂગમાંથી ઉત્પાદિત બીજકણ એક અઠવાડિયાની અંદર જુવારના નાના છોડમાં ચેપ શરૂ કરે છે.

બીજ તૈયારી

ખેતરમાં જુવારના બીજને રોપતા પહેલા ~ 1% Spirato 480 FS ફૂગનાશક, 4% Sebring 480 FS ફૂગનાશક, 3% Sorpro 940 ES સીડ સેફનર ધરાવતાં ફૂગનાશક, જંતુનાશક અને સલામત મિશ્રણથી સારવાર કરવામાં આવી હતી.પછી બીજને 3 દિવસ માટે હવામાં સૂકવવામાં આવ્યા હતા જે બીજની આસપાસ આ મિશ્રણનું પાતળું આવરણ પૂરું પાડે છે.સેફનર હર્બિસાઇડ ડ્યુઅલ મેગ્નમના ઉપયોગને પૂર્વ-ઉદભવ સારવાર તરીકે મંજૂરી આપે છે.

લક્ષ્ય લીફ સ્પોટ પ્રતિકારનું મૂલ્યાંકન

14-15 જૂન 2017 અને જૂન 20, 2018 ના રોજ ક્લેટોન, NCમાં સેન્ટ્રલ ક્રોપ્સ રિસર્ચ સ્ટેશન ખાતે દરેક કેસમાં બે પ્રાયોગિક પ્રતિકૃતિઓ સાથે રેન્ડમાઇઝ્ડ સંપૂર્ણ બ્લોક ડિઝાઇનમાં SCP રોપવામાં આવ્યું હતું.પ્લોટ દીઠ 10 બીજનો ઉપયોગ કરીને 0.9 મીટર પંક્તિની પહોળાઈ સાથે 1.8 મીટર સિંગલ પંક્તિઓમાં પ્રયોગો વાવવામાં આવ્યા હતા.ધારની અસરોને રોકવા માટે દરેક પ્રયોગની પરિઘની આસપાસ બે સરહદી પંક્તિઓ રોપવામાં આવી હતી.પ્રયોગો જુલાઇ 20, 2017 અને 20 જુલાઇ, 2018 ના રોજ ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા જે સમયે જુવારના છોડ વૃદ્ધિના સ્ટેજ 3 પર હતા. રેટિંગ એક થી નવ સ્કેલ પર લેવામાં આવ્યા હતા, જ્યાં રોગના કોઈ ચિહ્નો ન દર્શાવતા છોડને નવ અને સંપૂર્ણ રીતે સ્કોર કરવામાં આવ્યા હતા. મૃત છોડને એક તરીકે ગણવામાં આવ્યા હતા.2017માં બે રેટિંગ લેવામાં આવ્યા હતા અને 2018માં ચાર રીડિંગ્સ દર વર્ષે ઇનોક્યુલેશન પછીના બે અઠવાડિયાથી શરૂ થયા હતા.sAUDPC (રોગની પ્રગતિના વળાંક હેઠળ પ્રમાણભૂત વિસ્તાર)ની ગણતરી અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવી હતી.