જુવારમાં MAMP-પ્રેરિત સંરક્ષણ પ્રતિભાવ અને લક્ષ્ય પાંદડાના ટપકાં સામે પ્રતિકારની મજબૂતાઈનું જીનોમ-વ્યાપી સંગઠન વિશ્લેષણ

છોડ અને રોગકારક પદાર્થો

ઇલિનોઇસ યુનિવર્સિટી (હવે યુસી ડેવિસ ખાતે) ખાતે ડો. પેટ બ્રાઉન દ્વારા જુવાર કન્વર્ઝન પોપ્યુલેશન (SCP) તરીકે ઓળખાતી જુવાર એસોસિએશન મેપિંગ વસ્તી પૂરી પાડવામાં આવી હતી. તેનું વર્ણન અગાઉ કરવામાં આવ્યું છે અને તે યુએસ વાતાવરણમાં છોડના વિકાસ અને વિકાસને સરળ બનાવવા માટે ફોટોપીરિયડ-અસંવેદનશીલતા અને નાના કદમાં રૂપાંતરિત વિવિધ રેખાઓનો સંગ્રહ છે. આ અભ્યાસમાં આ વસ્તીમાંથી 510 રેખાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જોકે ખરાબ અંકુરણ અને અન્ય ગુણવત્તા નિયંત્રણ સમસ્યાઓને કારણે, ત્રણેય લક્ષણોના વિશ્લેષણમાં બધી રેખાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો. આખરે 345 રેખાઓમાંથી ડેટાનો ઉપયોગ ચિટિન પ્રતિભાવના વિશ્લેષણ માટે, 472 રેખાઓ flg22 પ્રતિભાવ માટે અને 456 TLS પ્રતિકાર માટે કરવામાં આવ્યો હતો.બી. કૂકેઇLSLP18 સ્ટ્રેન યુનિવર્સિટી ઓફ આર્કાન્સાસના ડો. બર્ટ બ્લુહમ પાસેથી મેળવવામાં આવ્યું હતું.

MAMP પ્રતિભાવ માપન

આ અભ્યાસમાં બે અલગ અલગ MAMPsનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો flg22, (Genscript catalog# RP19986), અને chitin. જુવારના છોડ ગ્રીનહાઉસમાં માટીથી ભરેલા ફ્લેટ (33% સનશાઇન રેડી-અર્થ પ્રો ગ્રોઇંગ મિક્સ) પર નાખવામાં આવેલા ઇન્સર્ટ્સમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. સંગ્રહના દિવસે પાંદડામાં વધારાની ભેજ ટાળવા માટે નમૂના સંગ્રહના આગલા દિવસે છોડને પાણી આપવામાં આવ્યું હતું.

આ લાઇનોને રેન્ડમાઇઝ્ડ કરવામાં આવી હતી અને, લોજિસ્ટિકલ કારણોસર, 60 લાઇનોના બેચમાં રોપવામાં આવી હતી. દરેક લાઇન માટે, દરેક લાઇન માટે બે બીજ સાથે ત્રણ 'પોટ્સ' રોપવામાં આવ્યા હતા. સમગ્ર વસ્તીનું મૂલ્યાંકન ન થાય ત્યાં સુધી પહેલાના બેચની પ્રક્રિયા પૂર્ણ થયા પછી તરત જ અનુગામી બેચ રોપવામાં આવ્યા હતા. બંને MAMP માટે બે પ્રાયોગિક રન હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા જેમાં દરેક બે રનમાં જીનોટાઇપ ફરીથી રેન્ડમાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા.

અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ROS પરીક્ષણો હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, દરેક લાઇન માટે, 3 અલગ અલગ કુંડામાં છ બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા. પરિણામી રોપાઓમાંથી, એકરૂપતાના આધારે ત્રણ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. જે રોપાઓ અસામાન્ય દેખાતા હતા અથવા મોટાભાગના કરતા નોંધપાત્ર રીતે ઊંચા અથવા ટૂંકા હતા તેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો. 15 દિવસ જૂના ત્રણ અલગ અલગ જુવારના છોડના ચોથા પાંદડાના પહોળા ભાગમાંથી 3 મીમી વ્યાસની ચાર પાંદડાની ડિસ્ક કાઢવામાં આવી હતી. બે છોડમાંથી દરેક પાંદડા માટે એક ડિસ્ક અને એક છોડમાંથી બે ડિસ્ક, બીજી ડિસ્ક પાણી નિયંત્રણ બની (નીચે જુઓ). ડિસ્કને કાળા 96-કુવા પ્લેટમાં 50 μl H20 પર વ્યક્તિગત રીતે તરતા મૂકવામાં આવ્યા હતા, પ્રકાશના સંપર્કમાં ન આવે તે માટે એલ્યુમિનિયમ સીલથી સીલ કરવામાં આવ્યા હતા, અને રાતોરાત ઓરડાના તાપમાને રાખવામાં આવ્યા હતા. બીજા દિવસે સવારે 2 mg/ml કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ પ્રોબ L-012 (વાકો, કેટલોગ # 120-04891), 2 mg/ml હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ (ટાઇપ VI-A, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, કેટલોગ # P6782), અને 100 mg/ml ચિટિન અથવા Flg22 ના 2 μM નો ઉપયોગ કરીને પ્રતિક્રિયા દ્રાવણ બનાવવામાં આવ્યું. આ પ્રતિક્રિયા દ્રાવણનો 50 μl ચારમાંથી ત્રણ કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવ્યો હતો. ચોથો કૂવો એક મોક કંટ્રોલ હતો, જેમાં MAMP સિવાય પ્રતિક્રિયા દ્રાવણ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. દરેક પ્લેટમાં ફક્ત પાણી ધરાવતા ચાર ખાલી કુવાઓનો પણ સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો.

પ્રતિક્રિયા દ્રાવણ ઉમેર્યા પછી, SynergyTM 2 મલ્ટી-ડિટેક્શન માઇક્રોપ્લેટ રીડર (બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને 1 કલાક માટે દર 2 મિનિટે લ્યુમિનેસેન્સ માપવામાં આવ્યું. આ 1 કલાક દરમિયાન પ્લેટ રીડર દર 2 મિનિટે લ્યુમિનેસેન્સ માપ લે છે. દરેક કૂવા માટે મૂલ્ય આપવા માટે તમામ 31 રીડિંગ્સનો સરવાળો ગણવામાં આવ્યો હતો. દરેક જીનોટાઇપ માટે MAMP પ્રતિભાવ માટે અંદાજિત મૂલ્યની ગણતરી (ત્રણ પ્રાયોગિક કુવાઓનું સરેરાશ લ્યુમિનેસેન્સ મૂલ્ય - મોક વેલ મૂલ્ય) - સરેરાશ ખાલી કૂવા મૂલ્યને બાદ કરીને કરવામાં આવી હતી. ખાલી કૂવાના મૂલ્યો સતત શૂન્યની નજીક હતા.

લીફ ડિસ્ક્સ ઓફનિકોટિઆના બેન્થેમિયાનાગુણવત્તા નિયંત્રણ હેતુઓ માટે દરેક 96-કુવા પ્લેટમાં નિયંત્રણો તરીકે એક ઉચ્ચ પ્રતિભાવશીલ જુવાર લાઇન (SC0003), અને એક ઓછી પ્રતિભાવશીલ જુવાર લાઇન (PI 6069) નો પણ સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો.

બી. કૂકેઇઇનોક્યુલમની તૈયારી અને ઇનોક્યુલેશન

બી. કૂકેઇઅગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ઇનોક્યુલમ તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, જુવારના દાણાને ત્રણ દિવસ પાણીમાં પલાળીને, ધોઈને, 1 લિટર શંકુ આકારના ફ્લાસ્કમાં સ્કૂપ કરીને 15psi અને 121 °C તાપમાને એક કલાક માટે ઓટોક્લેવ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ અનાજને તાજા કલ્ચરમાંથી લગભગ 5 મિલી મેસેરેટેડ માયસેલિયાથી ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા.બી. કૂકેઇLSLP18 ને અલગ કરીને ઓરડાના તાપમાને 2 અઠવાડિયા માટે છોડી દેવામાં આવે છે, દર 3 દિવસે ફ્લાસ્કને હલાવવામાં આવે છે. 2 અઠવાડિયા પછી, ફૂગથી પ્રભાવિત જુવારના દાણાને હવામાં સૂકવવામાં આવે છે અને પછી ખેતરમાં રસીકરણ થાય ત્યાં સુધી 4 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે. સમગ્ર અજમાયશ માટે સમાન ઇનોક્યુલમનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે અને દર વર્ષે તાજા બનાવવામાં આવે છે. ઇનોક્યુલેશન માટે, 4-5 અઠવાડિયા જૂના જુવારના છોડના ગોળામાં 6-10 ચેપગ્રસ્ત અનાજ મૂકવામાં આવે છે. આ ફૂગમાંથી ઉત્પન્ન થયેલા બીજકણ એક અઠવાડિયાની અંદર જુવારના નાના છોડમાં ચેપ શરૂ કરે છે.

બીજ તૈયારી

ખેતરમાં વાવેતર કરતા પહેલા જુવારના બીજને ફૂગનાશક, જંતુનાશક અને સેફેનર મિશ્રણથી સારવાર આપવામાં આવી હતી જેમાં ~ 1% સ્પિરાટો 480 FS ફૂગનાશક, 4% સેબ્રિંગ 480 FS ફૂગનાશક, 3% સોર્પ્રો 940 ES સીડ સેફેનરનો સમાવેશ થતો હતો. પછી બીજને 3 દિવસ સુધી હવામાં સૂકવવામાં આવ્યા હતા જેનાથી બીજની આસપાસ આ મિશ્રણનો પાતળો આવરણ બન્યો હતો. સેફેનરમાં ઉદભવ પહેલાની સારવાર તરીકે હર્બિસાઇડ ડ્યુઅલ મેગ્નમનો ઉપયોગ કરવાની મંજૂરી આપવામાં આવી હતી.

લક્ષ્ય પાંદડાના ટપકાંના પ્રતિકારનું મૂલ્યાંકન

SCP નું વાવેતર ૧૪-૧૫ જૂન ૨૦૧૭ અને ૨૦ જૂન ૨૦૧૮ ના રોજ ક્લેટન, NC માં સેન્ટ્રલ ક્રોપ રિસર્ચ સ્ટેશન ખાતે કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં દરેક કેસમાં બે પ્રાયોગિક પ્રતિકૃતિઓ હતી. દરેક પ્લોટમાં ૧૦ બીજનો ઉપયોગ કરીને ૦.૯ મીટર પંક્તિ પહોળાઈ સાથે ૧.૮ મીટર સિંગલ હરોળમાં પ્રયોગો રોપવામાં આવ્યા હતા. ધારની અસરોને રોકવા માટે દરેક પ્રયોગની પરિઘની આસપાસ બે સરહદી હરોળ રોપવામાં આવી હતી. ૨૦ જુલાઈ, ૨૦૧૭ અને ૨૦ જુલાઈ, ૨૦૧૮ ના રોજ પ્રયોગો ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા, તે સમયે જુવારના છોડ વૃદ્ધિના તબક્કા ૩ પર હતા. રેટિંગ એક થી નવ સ્કેલ પર લેવામાં આવ્યા હતા, જ્યાં રોગના કોઈ ચિહ્નો ન દર્શાવતા છોડને નવ તરીકે સ્કોર કરવામાં આવ્યા હતા અને સંપૂર્ણપણે મૃત છોડને એક તરીકે સ્કોર કરવામાં આવ્યા હતા. ૨૦૧૭ માં બે રેટિંગ લેવામાં આવ્યા હતા અને ૨૦૧૮ માં દર વર્ષે ઇનોક્યુલેશનના બે અઠવાડિયા પછી ચાર રીડિંગ્સ લેવામાં આવ્યા હતા. sAUDPC (રોગ પ્રગતિ વળાંક હેઠળ માનક વિસ્તાર) ની ગણતરી અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ કરવામાં આવી હતી.