છોડના સૂક્ષ્મ નળીઓને અસર કરતા નવા છોડ વૃદ્ધિ અવરોધકો તરીકે ઉર્સા મોનોએમાઇડ્સની શોધ, લાક્ષણિકતા અને કાર્યાત્મક સુધારણા.

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેના વર્ઝનમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે તમારા બ્રાઉઝરના નવા વર્ઝનનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). આ દરમિયાન, ચાલુ સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સ્ટાઇલિંગ અથવા JavaScript વિના સાઇટ બતાવી રહ્યા છીએ.
કુદરતી ઉત્પાદનોની શોધ અને ફાયદાકારક ઉપયોગ માનવ જીવનને સુધારવામાં મદદ કરી શકે છે. છોડના વિકાસ અવરોધક રસાયણોનો ઉપયોગ નીંદણને નિયંત્રિત કરવા માટે હર્બિસાઇડ્સ તરીકે વ્યાપકપણે થાય છે. વિવિધ પ્રકારના હર્બિસાઇડ્સનો ઉપયોગ કરવાની જરૂરિયાતને કારણે, ક્રિયાની નવી પદ્ધતિઓ સાથે સંયોજનો ઓળખવાની જરૂર છે. આ અભ્યાસમાં, અમે સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ વેરેન્સિસ MK493-CF1 માંથી એક નવલકથા N -alkoxypyrole સંયોજન, coumamonamide શોધી કાઢ્યું અને સંપૂર્ણ સંશ્લેષણ પ્રક્રિયા સ્થાપિત કરી. જૈવિક પ્રવૃત્તિ પરીક્ષણો દ્વારા, અમે શોધી કાઢ્યું કે urs-monoamic એસિડ એ urs-monoamide અને સંભવિતનું કૃત્રિમ મધ્યસ્થી છે.છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક. વધુમાં, અમે વિવિધ ઉર્બેનોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ વિકસાવ્યા છે, જેમાં ઉર્બેનોલોક્સી ડેરિવેટિવ (UDA)નો સમાવેશ થાય છે, જે HeLa કોષોના વિકાસને નકારાત્મક અસર કર્યા વિના ઉચ્ચ હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે. અમે એ પણ જોયું કે ઉર્મોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને વિક્ષેપિત કરે છે; વધુમાં, KAND એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરે છે અને કોષ મૃત્યુને પ્રેરિત કરે છે; આ બહુપક્ષીય અસરો જાણીતા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો કરતા અલગ છે અને ઉર્સોનિક એસિડ માટે ક્રિયાની નવી પદ્ધતિ સૂચવે છે, જે નવા હર્બિસાઇડ્સના વિકાસમાં એક મહત્વપૂર્ણ ફાયદો રજૂ કરે છે.
ફાયદાકારક કુદરતી ઉત્પાદનો અને તેમના ડેરિવેટિવ્ઝની શોધ અને વ્યવહારુ ઉપયોગ એ માનવ જીવનની ગુણવત્તા સુધારવાનું એક સાધન છે. સુક્ષ્મસજીવો, છોડ અને જંતુઓ દ્વારા ઉત્પાદિત ગૌણ ચયાપચય દવા અને કૃષિમાં મોટી પ્રગતિ તરફ દોરી ગયા છે. કુદરતી ઉત્પાદનોમાંથી ઘણી એન્ટિબાયોટિક્સ અને લ્યુકેમિયા વિરોધી દવાઓ વિકસાવવામાં આવી છે. વધુમાં, વિવિધ પ્રકારનાજંતુનાશકોઆ કુદરતી ઉત્પાદનોમાંથી કૃષિમાં ઉપયોગ માટે ફૂગનાશકો અને હર્બિસાઇડ્સ કાઢવામાં આવે છે. ખાસ કરીને, આધુનિક કૃષિમાં પાકની ઉપજ વધારવા માટે નીંદણ નિયંત્રણ હર્બિસાઇડ્સ મહત્વપૂર્ણ સાધનો છે, અને વિવિધ પ્રકારના સંયોજનોનો ઉપયોગ પહેલાથી જ વ્યાપારી રીતે થાય છે. છોડમાં ઘણી કોષીય પ્રક્રિયાઓ, જેમ કે પ્રકાશસંશ્લેષણ, એમિનો એસિડ ચયાપચય, કોષ દિવાલ સંશ્લેષણ, મિટોસિસનું નિયમન, ફાયટોહોર્મોન સિગ્નલિંગ અથવા પ્રોટીન સંશ્લેષણ, હર્બિસાઇડ્સના લાક્ષણિક લક્ષ્યો માનવામાં આવે છે. માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્યને અવરોધતા સંયોજનો હર્બિસાઇડ્સનો એક સામાન્ય વર્ગ છે જે મિટોટિક નિયમનને અસર કરીને છોડના વિકાસને અસર કરે છે.
માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સાયટોસ્કેલેટનના ઘટકો છે અને યુકેરીયોટિક કોષોમાં વ્યાપકપણે સંરક્ષિત છે. ટ્યુબ્યુલિન હેટરોડાઇમરમાં α-ટ્યુબ્યુલિન અને β-ટ્યુબ્યુલિન હોય છે જે રેખીય માઇક્રોટ્યુબ્યુલ પ્રોટોફિલેમેન્ટ બનાવે છે, જેમાં 13 પ્રોટોફિલેમેન્ટ નળાકાર માળખું બનાવે છે. માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ છોડના કોષોમાં બહુવિધ ભૂમિકાઓ ભજવે છે, જેમાં કોષનો આકાર નક્કી કરવો, કોષ વિભાજન અને અંતઃકોશિક પરિવહનનો સમાવેશ થાય છે3,4. છોડના કોષોમાં ઇન્ટરફેસ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન નીચે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ હોય છે, અને આ કહેવાતા કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સેલ્યુલોઝ સિન્થેઝ સંકુલ 4,5 ના નિયમન દ્વારા સેલ્યુલોઝ માઇક્રોફાઇબ્રિલ્સના સંગઠનને નિયંત્રિત કરવાનું માનવામાં આવે છે. મૂળના ટોચના ઝડપી વિસ્તરણના ક્ષેત્રમાં હાજર મૂળ બાહ્ય કોષોના કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ બાજુની બાજુમાં સ્થિત હોય છે, અને સેલ્યુલોઝ માઇક્રોફાઇબર્સ આ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અનુસરે છે અને કોષ વિસ્તરણની દિશા મર્યાદિત કરે છે, જેનાથી એનિસોટ્રોપિક કોષ વિસ્તરણને પ્રોત્સાહન મળે છે. તેથી, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્ય છોડના આકારશાસ્ત્ર સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. ટ્યુબ્યુલિનને એન્કોડ કરતા જનીનોમાં એમિનો એસિડ અવેજીઓ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ એરેના વિકૃતિ અને એરેબિડોપ્સિસ 6,7 માં ડાબી અથવા જમણી બાજુની વૃદ્ધિનું કારણ બને છે. તેવી જ રીતે, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-સંકળાયેલ પ્રોટીનમાં પરિવર્તન જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરે છે તે પણ વિકૃત મૂળ વૃદ્ધિ તરફ દોરી શકે છે8,9,10,11,12,13. વધુમાં, ડિસોપાયરામાઇડ, જેને પ્રીટીલાક્લોર તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-વિક્ષેપિત હર્બિસાઇડ્સ સાથેની સારવારથી પણ ડાબી બાજુની ત્રાંસી મૂળ વૃદ્ધિ થાય છે14. આ ડેટા સૂચવે છે કે છોડની વૃદ્ધિની દિશા નક્કી કરવા માટે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્યનું ચોક્કસ નિયમન મહત્વપૂર્ણ છે.
વિવિધ પ્રકારના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો શોધી કાઢવામાં આવ્યા છે, અને આ દવાઓએ સાયટોસ્કેલેટલ સંશોધન, તેમજ કૃષિ અને દવામાં નોંધપાત્ર યોગદાન આપ્યું છે. ખાસ કરીને, ઓરિઝાલિન, ડાયનાઇટ્રોએનિલિન સંયોજનો, ડિસોપીરામાઇડ, બેન્ઝામાઇડ-સંબંધિત સંયોજનો અને તેમના એનાલોગ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્યને અટકાવી શકે છે અને તેથી છોડના વિકાસને અટકાવી શકે છે. તેથી, તેનો વ્યાપકપણે હર્બિસાઇડ્સ તરીકે ઉપયોગ થાય છે. જો કે, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ છોડ અને પ્રાણી કોષોનો એક મહત્વપૂર્ણ ઘટક હોવાથી, મોટાભાગના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો બંને પ્રકારના કોષ માટે સાયટોટોક્સિક છે. તેથી, હર્બિસાઇડ્સ તરીકે તેમની માન્ય ઉપયોગીતા હોવા છતાં, વ્યવહારિક હેતુઓ માટે મર્યાદિત સંખ્યામાં એન્ટિમાઇક્રોટ્યુબ્યુલ એજન્ટોનો ઉપયોગ થાય છે.
સ્ટ્રેપ્ટોમાસીસ એ સ્ટ્રેપ્ટોમાસીસ પરિવારનો એક જીનસ છે, જેમાં એરોબિક, ગ્રામ-પોઝિટિવ, ફિલામેન્ટસ બેક્ટેરિયાનો સમાવેશ થાય છે અને તે ગૌણ ચયાપચયની વિશાળ શ્રેણી ઉત્પન્ન કરવાની ક્ષમતા માટે વ્યાપકપણે જાણીતું છે. તેથી, તેને નવા જૈવિક રીતે સક્રિય કુદરતી ઉત્પાદનોના સૌથી મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોતોમાંનું એક માનવામાં આવે છે. વર્તમાન અભ્યાસમાં, અમે કુમામોનામાઇડ નામનું એક નવું સંયોજન શોધી કાઢ્યું, જે સ્ટ્રેપ્ટોમાસીસ વેરેન્સિસ MK493-CF1 અને S. વેરેન્સિસ ISP 5486 થી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. સ્પેક્ટ્રલ વિશ્લેષણ અને સંપૂર્ણ સ્પેક્ટ્રલ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને, કુમામોનામાઇડનું માળખું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું અને તેનું અનન્ય N-alkoxypyrrole સ્કેલેટન નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. સંશ્લેષણ. ઉર્સમોનોમાઇડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝનું કૃત્રિમ મધ્યવર્તી, ઉર્સમોનિક એસિડ, લોકપ્રિય મોડેલ પ્લાન્ટ એરેબિડોપ્સિસ થાલિયાનાના વિકાસ અને અંકુરણને અટકાવતું જોવા મળ્યું. સ્ટ્રક્ચર-એક્ટિવિટી રિલેશનશિપ સ્ટડીમાં, અમને જાણવા મળ્યું કે C9 સાથેનું સંયોજન ઉર્સોનિક એસિડમાં સંશોધિત, જેને ઉર્સોનિક એસિડનું નોનાયલોક્સી ડેરિવેટિવ (KAND) કહેવાય છે, વૃદ્ધિ અને અંકુરણ પર અવરોધક અસરને નોંધપાત્ર રીતે વધારે છે. નોંધનીય છે કે, નવા શોધાયેલા છોડના વિકાસ અવરોધક તમાકુ અને લિવરવોર્ટના વિકાસને પણ અસર કરે છે અને બેક્ટેરિયા અથવા HeLa કોષો માટે સાયટોટોક્સિક નથી. વધુમાં, કેટલાક ઉર્મોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ વિકૃત મૂળ ફેનોટાઇપને પ્રેરિત કરે છે, જેનો અર્થ એ થાય છે કે આ ડેરિવેટિવ્ઝ સીધી કે આડકતરી રીતે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરે છે. આ વિચાર સાથે સુસંગત, ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ અથવા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન સાથે લેબલ થયેલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના અમારા અવલોકનો સૂચવે છે કે KAND સારવાર માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને ડિપોલિમરાઇઝ કરે છે. વધુમાં, કુમામોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ સાથેની સારવાર એક્ટિન માઇક્રોફિલામેન્ટ્સને વિક્ષેપિત કરે છે. આમ, અમે એક નવું છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક શોધી કાઢ્યું છે જેની ક્રિયાની અનન્ય પદ્ધતિ સાયટોસ્કેલેટનનો નાશ કરે છે.
ટોક્યોના શિનાગાવા-કુમાં માટીમાંથી સ્ટ્રેન MK493-CF1 ને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. સ્ટ્રેન MK493-CF1 એ સારી રીતે શાખાવાળું સ્ટ્રોમલ માયસેલિયમ બનાવ્યું હતું. 16S રિબોસોમલ RNA જનીન (1422 bp) નો આંશિક ક્રમ નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો. આ સ્ટ્રેન S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: લાક્ષણિક સ્ટ્રેન, 99.93%) જેવું જ છે. આ પરિણામના આધારે, એવું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું કે આ સ્ટ્રેન S. werraensis ના પ્રકારના સ્ટ્રેન સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. તેથી, અમે આ સ્ટ્રેનને કામચલાઉ નામ આપ્યું S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T પણ સમાન બાયોએક્ટિવ સંયોજનો ઉત્પન્ન કરે છે. આ સૂક્ષ્મજીવમાંથી કુદરતી ઉત્પાદનો મેળવવા માટે પ્રારંભિક સંશોધન બહુ ઓછું હોવાથી, વધુ રાસાયણિક સંશોધન હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. 14 દિવસ સુધી 30°C તાપમાને ઘન-અવસ્થા આથો દ્વારા જવ માધ્યમ પર S. werraensis MK493-CF1 ની ખેતી કર્યા પછી, માધ્યમ 50% EtOH સાથે કાઢવામાં આવ્યું. 59.5 મિલિગ્રામ ક્રૂડ અર્ક મેળવવા માટે 60 મિલી નમૂનાને સૂકવવામાં આવ્યો. N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, નામ કુમામોનામાઇડ, 36.0 મિલિગ્રામ) આપવા માટે ક્રૂડ અર્કને રિવર્સ ફેઝ HPLC ને આધિન કરવામાં આવ્યો. 1 ની કુલ માત્રા ક્રૂડ અર્કના આશરે 60% છે. તેથી, અમે કુમામોટોમાઇડ 1 ના ગુણધર્મોનો વિગતવાર અભ્યાસ કરવાનું નક્કી કર્યું.
કુમામોનામાઇડ 1 એ સફેદ આકારહીન પાવડર છે અને ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (HRESIMS) C6H8N2O2 (આકૃતિ 1) ની પુષ્ટિ કરે છે. આ સંયોજનનો C2-અવેજીકૃત પાયરોલ ટુકડો δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR સ્પેક્ટ્રમમાં: 4.5 Hz, H-5) અને δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, અને 13C NMR સ્પેક્ટ્રમ ચાર sp2 કાર્બન અણુઓની હાજરી દર્શાવે છે. C2 સ્થાન પર એમાઇડ જૂથની હાજરીનું મૂલ્યાંકન δC 161.1 પર C-3 પ્રોટોનથી એમાઇડ કાર્બોનિલ કાર્બન સાથે HMBC સહસંબંધ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં, δH 4.10 (3H, S) અને δC 68.3 પર 1 H અને 13 C NMR શિખરો પરમાણુમાં N-મેથોક્સી જૂથોની હાજરી દર્શાવે છે. જોકે મેથોક્સી જૂથની સાચી સ્થિતિ હજુ સુધી સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક વિશ્લેષણ જેમ કે ઉન્નત ડિફરન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી અને ન્યુક્લિયર ઓવરહાઉસર સંક્ષિપ્ત નામ (NOEDF) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવી ન હતી, N-મેથોક્સી-1H-pyrrole-2-carboxamide પ્રથમ ઉમેદવાર સંયોજન બન્યું.
1 ની સાચી રચના નક્કી કરવા માટે, કુલ સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું (આકૃતિ 2a). વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ 2-એમિનોપાયરિડિન 2 ની m-CPBA સાથે સારવારના પરિણામે જથ્થાત્મક ઉપજમાં અનુરૂપ N-ઓક્સાઇડ 3 મળ્યું. 2 ના 2-એમિનોઆઝાઇડેશન પછી, અબ્રામોવિચ દ્વારા વર્ણવેલ સાયક્લોકન્ડેન્સેશન પ્રતિક્રિયા 90°C પર બેન્ઝીનમાં હાથ ધરવામાં આવી જેથી ઇચ્છિત 1-હાઇડ્રોક્સી-1H-પાયરોલ-2-કાર્બોનિટ્રાઇલ 5 ગ્રામમાં મેળવી શકાય. ગતિ 60% (બે તબક્કા). 15,16. 4 ના મેથિલેશન અને હાઇડ્રોલિસિસ પછી 1-મેથોક્સી-1H-પાયરોલ-2-કાર્બોક્સિલિક એસિડ (જેને "ક્યુમોટોનિક એસિડ" કહેવાય છે, 6) સારી ઉપજમાં (70%, બે પગલાં) આપ્યું. અંતે, જલીય એમોનિયાનો ઉપયોગ કરીને એસિડ ક્લોરાઇડ ઇન્ટરમીડિયેટ 6 દ્વારા એમિડેશનથી 98% ઉપજમાં કુમામોટો એમાઇડ 1 મળ્યું. સંશ્લેષિત 1 નો તમામ સ્પેક્ટ્રલ ડેટા આઇસોલેટેડ 1 જેવો જ હતો, તેથી 1 ની રચના નક્કી કરવામાં આવી હતી;
ઉર્બેનામાઇડ અને ઉર્બેનિક એસિડની જૈવિક પ્રવૃત્તિનું સામાન્ય સંશ્લેષણ અને વિશ્લેષણ. (a) કુમામોટો એમાઇડનું કુલ સંશ્લેષણ. (b) સાત દિવસ જૂના જંગલી પ્રકારના અરેબિડોપ્સિસ કોલંબિયા (કોલ) રોપાઓ મુરાશિગે અને સ્કૂગ (MS) પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા જેમાં કુમામોનામાઇડ 6 અથવા કુમામોનામાઇડ 1 દર્શાવેલ સાંદ્રતા પર હતા. સ્કેલ બાર = 1 સે.મી.
સૌપ્રથમ, અમે છોડના વિકાસને નિયંત્રિત કરવાની તેમની ક્ષમતા માટે ઉર્બેનામાઇડ અને તેના મધ્યસ્થીઓની જૈવિક પ્રવૃત્તિઓનું મૂલ્યાંકન કર્યું. અમે MS અગર માધ્યમમાં ઉર્સમોનામાઇડ 1 અથવા ઉર્સમોનિક એસિડ 6 ની વિવિધ સાંદ્રતા ઉમેરી અને આ માધ્યમ પર અરેબિડોપ્સિસ થાલિયાના રોપાઓનું સંવર્ધન કર્યું. આ પરીક્ષણો દર્શાવે છે કે 6 ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા (500 μM) મૂળ વૃદ્ધિને અટકાવે છે (આકૃતિ 2b). આગળ, અમે 6 ની N1 સ્થિતિને બદલીને વિવિધ ડેરિવેટિવ્ઝ ઉત્પન્ન કર્યા અને તેમના પર માળખું-પ્રવૃત્તિ સંબંધ અભ્યાસ હાથ ધર્યા (એનાલોગ સંશ્લેષણ પ્રક્રિયા સહાયક માહિતી (SI) માં વર્ણવેલ છે). અરેબિડોપ્સિસ રોપાઓ 50 μM ઉર્સોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા, અને મૂળની લંબાઈ માપવામાં આવી હતી. જેમ કે ચિત્રમાં બતાવ્યું છે. આકૃતિઓ 3a, b, અને S1 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, કુમામો એસિડમાં N1 સ્થાન પર રેખીય આલ્કોક્સી સાંકળો (9, 10, 11, 12, અને 13) અથવા મોટી આલ્કોક્સી સાંકળો (15, 16, અને 17) ની લંબાઈ અલગ અલગ હોય છે. ડેરિવેટિવ્ઝે મૂળ વૃદ્ધિમાં નોંધપાત્ર અવરોધ દર્શાવ્યો હતો. વધુમાં, અમને જાણવા મળ્યું કે 200 μM 10, 11, અથવા 17 નો ઉપયોગ અંકુરણને અવરોધે છે (આકૃતિઓ 3c અને S2).
કુમામોટો એમાઇડ અને સંબંધિત સંયોજનોના બંધારણ-પ્રવૃત્તિ સંબંધનો અભ્યાસ. (a) એનાલોગની રચના અને સંશ્લેષણ યોજના. (b) 50 μM કુમામોનામાઇડ ડેરિવેટિવ્ઝ સાથે અથવા વગર MS માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા 7-દિવસના રોપાઓના મૂળ લંબાઈનું પ્રમાણ. ફૂદડી શેમ ટ્રીટમેન્ટ સાથે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (t પરીક્ષણ, p< 0.05). n>૧૮. ડેટા સરેરાશ ± SD તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યો છે. nt નો અર્થ "પરીક્ષણ કરાયેલ નથી" કારણ કે ૫૦% થી વધુ બીજ અંકુરિત થયા નથી. (c) ૨૦૦ μM કુમામોનામાઇડ અને સંબંધિત સંયોજનો સાથે અથવા વગર MS માધ્યમમાં ૭ દિવસ માટે ઉકાળેલા સારવાર કરાયેલા બીજના અંકુરણ દરનું પ્રમાણ. ફૂદડી શેમ ટ્રીટમેન્ટ (ચી-સ્ક્વેર ટેસ્ટ) સાથે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે. n=૯૬.
રસપ્રદ વાત એ છે કે, C9 કરતા લાંબી આલ્કિલ સાઇડ ચેઇન ઉમેરવાથી અવરોધક પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો થયો, જે સૂચવે છે કે કુમામોટોઇક એસિડ-સંબંધિત સંયોજનોને તેમની જૈવિક પ્રવૃત્તિ દર્શાવવા માટે ચોક્કસ કદની સાઇડ ચેઇનની જરૂર પડે છે.
કારણ કે રચના-પ્રવૃત્તિ સંબંધ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે C9 ને ઉર્સોનિક એસિડમાં સંશોધિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ઉર્સોનિક એસિડ (ત્યારબાદ KAND 11 તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) નું નોનાયલોક્સી ડેરિવેટિવ સૌથી અસરકારક છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક હતું, અમે KAND 11 નું વધુ વિગતવાર વર્ણન હાથ ધર્યું. 50 μM KAND 11 સાથે અરેબિડોપ્સિસની સારવાર લગભગ સંપૂર્ણપણે અંકુરણ અટકાવે છે, જ્યારે KAND 11 ની ઓછી સાંદ્રતા (40, 30, 20, અથવા 10 μM) એ ડોઝ-આધારિત રીતે મૂળ વૃદ્ધિને અટકાવે છે (આકૃતિ 4a, b). KAND 11 મૂળ મેરિસ્ટેમ સધ્ધરતાને અસર કરે છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ (PI) થી રંગાયેલા મૂળ મેરિસ્ટેમની તપાસ કરી અને મેરિસ્ટેમ વિસ્તારનું કદ માપ્યું. 25 μM KAND-11 ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓના મેરિસ્ટેમનું કદ 151.1 ± 32.5 μm હતું, જ્યારે DMSO ધરાવતા નિયંત્રણ માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓના મેરિસ્ટેમનું કદ 264.7 ± 30.8 μm હતું (આકૃતિ 4c, d), જે દર્શાવે છે કે KAND-11 કોષીય પ્રવૃત્તિને પુનઃસ્થાપિત કરે છે. ફેલાવો. મૂળ મેરિસ્ટેમ. આ સાથે સુસંગત, KAND 11 સારવારથી મૂળ મેરિસ્ટેમમાં કોષ વિભાજન માર્કર CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS સિગ્નલનું પ્રમાણ ઘટ્યું (આકૃતિ 4e) 17. આ પરિણામો દર્શાવે છે કે KAND 11 કોષ પ્રસાર પ્રવૃત્તિ ઘટાડીને મૂળ વૃદ્ધિને અટકાવે છે.
વૃદ્ધિ પર અર્બેનોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ (અર્બેનોલોક્સી ડેરિવેટિવ્ઝ) ની અવરોધક અસરનું વિશ્લેષણ. (a) KAND 11 ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા સાથે MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા 7-દિવસ જૂના જંગલી પ્રકારના કોલ રોપાઓ. સ્કેલ બાર = 1 સે.મી.. (b) મૂળ લંબાઈનું પ્રમાણ. અક્ષરો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (ટ્યુકી HSD પરીક્ષણ, p< 0.05). n>૧૬. ડેટા સરેરાશ ± SD તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યો છે. (c) 25 μM KAND સાથે અથવા વગર MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ-સ્ટેઇન્ડ વાઇલ્ડ-ટાઇપ કોલ મૂળની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી ૧૧. સફેદ કૌંસ રુટ મેરિસ્ટેમ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર = ૧૦૦ µm. (d) રુટ મેરિસ્ટેમ કદનું પ્રમાણીકરણ (n = ૧૦ થી ૧૧). ટી-ટેસ્ટ (p) નો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય તફાવતો નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.< 0.05). બાર સરેરાશ મેરિસ્ટેમ કદ દર્શાવે છે. (e) CDKB2 રચના ધરાવતા રુટ મેરિસ્ટેમની ડિફરન્શિયલ ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ (DIC) માઇક્રોસ્કોપી; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND પરીક્ષણ સાથે અથવા વગર MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા 5-દિવસ જૂના રોપાઓ પર 1-GUS સ્ટેઇન્ડ અને સ્ટેઇન્ડ.
KAND 11 ની ફાયટોટોક્સિસિટીનું પરીક્ષણ બીજા દ્વિભાજક છોડ, તમાકુ (નિકોટિઆના ટેબેકમ) અને મુખ્ય ભૂમિ છોડ મોડેલ સજીવ, લિવરવોર્ટ (માર્ચેન્ટિયા પોલીમોર્ફા) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. એરેબિડોપ્સિસના કિસ્સામાં, 25 μM KAND 11 ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા તમાકુ SR-1 રોપાઓ ટૂંકા મૂળ ઉત્પન્ન કરે છે (આકૃતિ 5a). વધુમાં, 48 માંથી 40 બીજ 200 μM KAND 11 ધરાવતી પ્લેટો પર અંકુરિત થયા, જ્યારે બધા 48 બીજ મોક-ટ્રીટેડ મીડિયા પર અંકુરિત થયા, જે દર્શાવે છે કે KAND ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા નોંધપાત્ર હતી (p< 0.05; ચી ટેસ્ટ -સ્ક્વેર) તમાકુના અંકુરણને અટકાવે છે. (આકૃતિ 5b). વધુમાં, લિવરવોર્ટમાં બેક્ટેરિયાના વિકાસને અટકાવતી KAND 11 ની સાંદ્રતા એરેબિડોપ્સિસ (આકૃતિ 5c) માં અસરકારક સાંદ્રતા જેવી જ હતી. આ પરિણામો સૂચવે છે કે KAND 11 વિવિધ છોડના વિકાસને અટકાવી શકે છે. ત્યારબાદ અમે અન્ય સજીવોમાં રીંછ મોનોએમાઇડ-સંબંધિત સંયોજનોની સંભવિત સાયટોટોક્સિસિટીની તપાસ કરી, જેમ કે માનવ HeLa કોષો અને એસ્ચેરીચિયા કોલી સ્ટ્રેન DH5α, ઉચ્ચ પ્રાણી અને બેક્ટેરિયલ કોષોના પ્રતિનિધિઓ તરીકે, અનુક્રમે. કોષ પ્રસાર પરીક્ષણોની શ્રેણીમાં, અમે અવલોકન કર્યું કે કુમામોનામાઇડ 1, કુમામોનામાઇડિક એસિડ 6, અને KAND 11 100 μM ની સાંદ્રતા પર HeLa અથવા E. coli કોષોના વિકાસને અસર કરતા નથી (આકૃતિ 5d,e).
નોન-અરેબિડોપ્સિસ સજીવોમાં KAND 11 નો વિકાસ અવરોધ. (a) બે અઠવાડિયા જૂના જંગલી પ્રકારના SR-1 તમાકુના રોપાઓ 25 μM KAND 11 ધરાવતી ઊભી સ્થિતિમાં MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. (b) બે અઠવાડિયા જૂના જંગલી પ્રકારના SR-1 તમાકુના રોપાઓ 200 μM KAND 11 ધરાવતી આડી સ્થિતિમાં MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. (c) KAND 11 ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા સાથે ગેમ્બોર્ગ B5 પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા બે અઠવાડિયા જૂના જંગલી પ્રકારના Tak-1 લિવરવોર્ટ કળીઓ. લાલ તીર એવા બીજકણ સૂચવે છે જે બે અઠવાડિયાના ઇન્ક્યુબેશન સમયગાળામાં વધવાનું બંધ કરી દે છે. (d) HeLa કોષોનું કોષ પ્રસાર પરીક્ષણ. કોષ ગણતરી કીટ 8 (ડોજિંડો) નો ઉપયોગ કરીને નિશ્ચિત સમય અંતરાલ પર સક્ષમ કોષોની સંખ્યા માપવામાં આવી હતી. નિયંત્રણ તરીકે, HeLa કોષોને 5 μg/ml એક્ટિનોમાસીન D (એક્ટ D) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જે RNA પોલિમરેઝ ટ્રાન્સક્રિપ્શનને અટકાવે છે અને કોષ મૃત્યુનું કારણ બને છે. વિશ્લેષણ ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવ્યા હતા. (e) E. કોલી કોષ પ્રસાર પરીક્ષણ. OD600 માપીને ઇ. કોલાઇ વૃદ્ધિનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. નિયંત્રણ તરીકે, કોષોને 50 μg/ml એમ્પીસિલિન (Amp) થી સારવાર આપવામાં આવી, જે બેક્ટેરિયલ કોષ દિવાલ સંશ્લેષણને અટકાવે છે. વિશ્લેષણ ત્રણ પ્રતિકૃતિમાં કરવામાં આવ્યા હતા.
યુરામાઇડ-સંબંધિત સંયોજનો દ્વારા થતી સાયટોટોક્સિસિટીની ક્રિયાની પદ્ધતિને સમજવા માટે, અમે મધ્યમ અવરોધક અસરો સાથે યુર્બેનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝનું ફરીથી વિશ્લેષણ કર્યું. જેમ કે તે ચિત્રમાં બતાવ્યું છે. આકૃતિઓ 2b, 6a માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઉર્મોટોનિક એસિડ 6 ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા (200 μM) ધરાવતી અગર પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓએ ટૂંકા અને ડાબા-વક્ર મૂળ (θ = – 23.7 ± 6.1) ઉત્પન્ન કર્યા, જ્યારે નિયંત્રણ માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓમાંથી, રોપાઓએ લગભગ સીધા મૂળ (θ = – 3.8 ± 7.1) ઉત્પન્ન કર્યા. આ લાક્ષણિક ત્રાંસી વૃદ્ધિ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ 14,18 ના નિષ્ક્રિયતાને કારણે થાય છે. આ શોધ સાથે સુસંગત, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-અસ્થિર કરતી દવાઓ ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરિઝાલિન અમારી વૃદ્ધિની પરિસ્થિતિઓમાં સમાન મૂળ ઝુકાવને પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિઓ 2b, 6a). તે જ સમયે, અમે ઉર્મોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝનું પરીક્ષણ કર્યું અને તેમાંથી ઘણા પસંદ કર્યા જે ચોક્કસ સાંદ્રતા પર, ત્રાંસી મૂળ વૃદ્ધિને પ્રેરિત કરે છે. સંયોજનો 8, 9, અને 15 એ મૂળ વૃદ્ધિની દિશા અનુક્રમે 75 μM, 50 μM અને 40 μM પર બદલી, જે દર્શાવે છે કે આ સંયોજનો માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસરકારક રીતે અસ્થિર કરી શકે છે (આકૃતિ 2b, 6a). અમે સૌથી શક્તિશાળી યુર્સોલિક એસિડ ડેરિવેટિવ, KAND 11, ની ઓછી સાંદ્રતા (15 μM) પર પણ પરીક્ષણ કર્યું અને જાણવા મળ્યું કે KAND 11 નો ઉપયોગ મૂળ વૃદ્ધિને અટકાવે છે અને મૂળ વૃદ્ધિની દિશા અસમાન હતી, જોકે તેઓ ડાબી તરફ ઢાળ તરફ વલણ ધરાવે છે (આકૃતિ C3). કારણ કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-અસ્થિર કરતી દવાઓની ઉચ્ચ સાંદ્રતા ક્યારેક મૂળ ઝુકાવવાને બદલે છોડના વિકાસને અટકાવે છે, અમે ત્યારબાદ મૂળના બાહ્ય ત્વચા કોષોમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું અવલોકન કરીને KAND 11 માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરે છે તેવી શક્યતાનું મૂલ્યાંકન કર્યું. 25 μM KAND 11 સાથે સારવાર કરાયેલા બીજ મૂળના બાહ્યત્વચા કોષોમાં એન્ટિ-β-ટ્યુબ્યુલિન એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રીમાં એલોંગેશન ઝોનમાં બાહ્યત્વચા કોષોમાં લગભગ તમામ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ ગાયબ થઈ ગયા હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 6b). આ પરિણામો દર્શાવે છે કે કુમામોટોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર પ્રત્યક્ષ કે પરોક્ષ રીતે કાર્ય કરે છે જેથી તેમને વિક્ષેપિત કરી શકાય અને આ સંયોજનો નવા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો છે.
ઉર્સોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ એરેબિડોપ્સિસ થાલિયાનામાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સમાં ફેરફાર કરે છે. (a) દર્શાવેલ સાંદ્રતા પર વિવિધ ઉર્મોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝની હાજરીમાં માપવામાં આવેલા મૂળના ઝોક કોણ. માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને રોકવા માટે જાણીતા બે સંયોજનોની અસરોનું પણ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું: ડિસોપીરામાઇડ અને ઓરિઝાલિન. ઇનસેટ મૂળ વૃદ્ધિ કોણ માપવા માટે વપરાતા ધોરણ દર્શાવે છે. ફૂદડી શેમ ટ્રીટમેન્ટ (t ટેસ્ટ, p) સાથે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.< 0.05). n>19. સ્કેલ બાર = 1 સે.મી. (b) એલોંગેશન ઝોનમાં એપિડર્મલ કોષોમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ. 25 μM KAND 11 સાથે અથવા વગર MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા જંગલી પ્રકારના એરેબિડોપ્સિસ કોલ મૂળમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને β-ટ્યુબ્યુલિન પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ અને એલેક્સા ફ્લોર-કન્જુગેટેડ સેકન્ડરી એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગ દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા. સ્કેલ બાર = 10 µm. (c) રુટ મેરીસ્ટેમમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું માઇટોટિક માળખું. ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગનો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું વિઝ્યુઅલાઈઝેશન કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોફેસ ઝોન, સ્પિન્ડલ્સ અને ફ્રેગ્મોપ્લાસ્ટ સહિત માઇટોટિક માળખાં, કોન્ફોકલ છબીઓમાંથી ગણવામાં આવ્યા હતા. તીર માઇટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ માળખાં સૂચવે છે. ફૂદડી શેમ ટ્રીટમેન્ટ (t ટેસ્ટ, p) સાથે નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે.< 0.05). n>9. સ્કેલ બાર = 50 µm.
ઉર્સામાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્યને વિક્ષેપિત કરવાની ક્ષમતા હોવા છતાં, તેની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ લાક્ષણિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટો કરતા અલગ હોવાની અપેક્ષા છે. ઉદાહરણ તરીકે, ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરિઝાલિન જેવા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટોની ઉચ્ચ સાંદ્રતા એપિડર્મલ કોષોના એનિસોટ્રોપિક વિસ્તરણને પ્રેરિત કરે છે, જ્યારે KAND 11 એવું કરતું નથી. વધુમાં, KAND 11 અને ડિસોપાયરામાઇડના સહ-એપ્લિકેશનના પરિણામે સંયુક્ત ડિસોપાયરામાઇડ-પ્રેરિત મૂળ વૃદ્ધિ પ્રતિભાવ અને KAND 11-પ્રેરિત વૃદ્ધિ અવરોધ જોવા મળ્યો (આકૃતિ S4). અમે અતિસંવેદનશીલ ડિસોપાયરામાઇડ 1-1 (phs1-1) મ્યુટન્ટના KAND 11 પ્રત્યેના પ્રતિભાવનું પણ વિશ્લેષણ કર્યું. phs1-1 માં નોન-કેનોનિકલ ટ્યુબ્યુલિન કાઇનેઝ પોઇન્ટ મ્યુટેશન છે અને ડિસોપાયરામાઇડ 9,20 સાથે સારવાર કરવામાં આવે ત્યારે તે ટૂંકા મૂળ ઉત્પન્ન કરે છે. KAND 11 ધરાવતા અગર માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા phs1-1 મ્યુટન્ટ રોપાઓમાં ડિસોપાયરામિડ (આકૃતિ S5) પર ઉગાડવામાં આવેલા મૂળ જેવા ટૂંકા મૂળ હતા.
વધુમાં, અમે KAND 11 થી સારવાર કરાયેલા રોપાઓના મૂળ મેરિસ્ટેમમાં પ્રોફેસ ઝોન, સ્પિન્ડલ્સ અને ફ્રેગ્મોપ્લાસ્ટ જેવા મિટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ માળખાં જોયા. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS માટેના અવલોકનો સાથે સુસંગત, મિટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સની સંખ્યામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો જોવા મળ્યો (આકૃતિ .6c).
સબસેલ્યુલર રિઝોલ્યુશન પર KAND 11 ની સાયટોટોક્સિસિટી દર્શાવવા માટે, અમે KAND 11 સાથે તમાકુ BY-2 સસ્પેન્શન કોષોની સારવાર કરી અને તેમના પ્રતિભાવનું અવલોકન કર્યું. કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર KAND 11 ની અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે સૌપ્રથમ TagRFP-TUA6 વ્યક્ત કરતા BY-2 કોષોમાં KAND 11 ઉમેર્યું, જે ફ્લોરોસન્ટલી માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને લેબલ કરે છે. કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઘનતાનું મૂલ્યાંકન છબી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, જેણે સાયટોપ્લાઝમિક પિક્સેલ્સમાં સાયટોસ્કેલેટલ પિક્સેલ્સની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું. પરીક્ષણ પરિણામો દર્શાવે છે કે 1 કલાક માટે 50 μM અથવા 100 μM KAND 11 સાથે સારવાર પછી, ઘનતા નોંધપાત્ર રીતે ઘટીને અનુક્રમે 0.94 ± 0.74% અથવા 0.23 ± 0.28% થઈ ગઈ, જ્યારે DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ કોષોની ઘનતા, 1.61 ± 0.34% (આકૃતિ 7a) હતી. આ પરિણામો Arabidopsis માં થયેલા અવલોકન સાથે સુસંગત છે કે KAND 11 સારવાર કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના ડિપોલિમરાઇઝેશનને પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિ 6b). KAND 11 ની સમાન સાંદ્રતા સાથે સારવાર પછી અમે GFP-ABD-લેબલવાળા એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ સાથે BY-2 લાઇનની પણ તપાસ કરી અને અવલોકન કર્યું કે KAND 11 સારવારથી એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સમાં વિક્ષેપ પડ્યો. 50 μM અથવા 100 μM KAND 11 સાથે 1 કલાક માટે સારવારથી એક્ટિન ફિલામેન્ટ ઘનતા અનુક્રમે 1.20 ± 0.62% અથવા 0.61 ± 0.26% સુધી નોંધપાત્ર રીતે ઘટી ગઈ, જ્યારે DMSO-સારવાર કરાયેલ કોષોમાં ઘનતા 1.69 ± 0.51% હતી (આકૃતિ 2). 7b). આ પરિણામો પ્રોપીઝામાઇડની અસરોથી વિપરીત છે, જે એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરતું નથી, અને લેટ્રુનક્યુલિન B, એક એક્ટિન ડિપોલિમરાઇઝર જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરતું નથી (SI આકૃતિ S6). વધુમાં, કુમામોનામાઇડ 1, કુમામોનામાઇડ એસિડ 6, અથવા KAND 11 સાથેની સારવારથી HeLa કોષોમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર કોઈ અસર થઈ નથી (SI આકૃતિ S7). આમ, KAND 11 ની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ જાણીતા સાયટોસ્કેલેટન ડિસપ્ટર્સ કરતા અલગ હોવાનું માનવામાં આવે છે. વધુમાં, KAND 11 સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોના અમારા સૂક્ષ્મ અવલોકનથી KAND 11 સારવાર દરમિયાન કોષ મૃત્યુની શરૂઆત જાહેર થઈ અને દર્શાવવામાં આવ્યું કે KAND 11 સારવારના 30 મિનિટ પછી ઇવાન્સ વાદળી રંગના મૃત કોષોનું પ્રમાણ નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું નથી, જ્યારે 50 μM અથવા 100 μM KAND સાથે 90 મિનિટની સારવાર પછી, મૃત કોષોની સંખ્યા અનુક્રમે 43.7% અથવા 80.1% થઈ ગઈ (આકૃતિ 7c). એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા સૂચવે છે કે નવલકથા યુર્સોલિક એસિડ ડેરિવેટિવ KAND 11 એ છોડ-વિશિષ્ટ સાયટોસ્કેલેટલ અવરોધક છે જેની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ અગાઉ અજાણી હતી.
KAND કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ, એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ અને તમાકુ BY-2 કોષોની કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે. (a) TagRFP-TUA6 ની હાજરીમાં BY-2 કોષોમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું વિઝ્યુલાઇઝેશન. KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરવામાં આવી હતી. કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઘનતાની ગણતરી 25 સ્વતંત્ર કોષોના માઇક્રોગ્રાફ્સમાંથી કરવામાં આવી હતી. અક્ષરો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (ટુકી HSD પરીક્ષણ, p< 0.05). સ્કેલ બાર = 10 µm. (b) GFP-ABD2 ની હાજરીમાં વિઝ્યુઅલાઈઝ્ડ BY-2 કોષોમાં કોર્ટિકલ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ. KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરવામાં આવી હતી. કોર્ટિકલ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સની ઘનતાની ગણતરી 25 સ્વતંત્ર કોષોના માઇક્રોગ્રાફ્સમાંથી કરવામાં આવી હતી. અક્ષરો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (ટુકી HSD પરીક્ષણ, p< 0.05). સ્કેલ બાર = 10 µm. (c) ઇવાન્સ બ્લુ સ્ટેનિંગ દ્વારા મૃત BY-2 કોષોનું અવલોકન. KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોનું તેજસ્વી-ક્ષેત્ર માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. n=3. સ્કેલ બાર = 100 µm.
નવા કુદરતી ઉત્પાદનોની શોધ અને ઉપયોગથી માનવ જીવનના વિવિધ પાસાઓમાં નોંધપાત્ર પ્રગતિ થઈ છે, જેમાં દવા અને કૃષિનો સમાવેશ થાય છે. કુદરતી સંસાધનોમાંથી ઉપયોગી સંયોજનો મેળવવા માટે ઐતિહાસિક સંશોધન હાથ ધરવામાં આવ્યું છે. ખાસ કરીને, એક્ટિનોમાસીટ્સ નેમાટોડ્સ માટે એન્ટિપેરાસાઇટિક એન્ટિબાયોટિક્સ તરીકે ઉપયોગી હોવાનું જાણીતું છે કારણ કે તેમની ક્ષમતા વિવિધ ગૌણ ચયાપચય ઉત્પન્ન કરવાની ક્ષમતા ધરાવે છે જેમ કે એવરમેક્ટીન, આઇવરમેક્ટીન અને બ્લોમાયસીનનું મુખ્ય સંયોજન અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ, જેનો ઉપયોગ કેન્સર વિરોધી એજન્ટ તરીકે થાય છે21,22. તેવી જ રીતે, એક્ટિનોમાસીટ્સમાંથી વિવિધ પ્રકારના હર્બિસાઇડલ સંયોજનો શોધવામાં આવ્યા છે, જેમાંથી કેટલાક પહેલાથી જ વ્યાવસાયિક રીતે ઉપયોગમાં લેવાય છે1,23. તેથી, ઇચ્છિત જૈવિક પ્રવૃત્તિઓ સાથે કુદરતી ઉત્પાદનોને અલગ કરવા માટે એક્ટિનોમાસીટ મેટાબોલાઇટ્સનું વિશ્લેષણ એક અસરકારક વ્યૂહરચના માનવામાં આવે છે. આ અભ્યાસમાં, અમે એસ. વેરેન્સિસમાંથી એક નવું સંયોજન, કુમામોનામાઇડ શોધી કાઢ્યું અને તેને સફળતાપૂર્વક સંશ્લેષણ કર્યું. ઉર્સોનિક એસિડ એ ઉર્બેનામાઇડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝનું કૃત્રિમ મધ્યસ્થી છે. તે લાક્ષણિક મૂળ કર્લિંગનું કારણ બની શકે છે, મધ્યમથી મજબૂત હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિ પ્રદર્શિત કરી શકે છે અને છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને સીધા કે પરોક્ષ રીતે નુકસાન પહોંચાડી શકે છે. જોકે, ઉર્મોટોનિક એસિડની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ હાલના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો કરતા અલગ હોઈ શકે છે, કારણ કે KAND 11 એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને પણ વિક્ષેપિત કરે છે અને કોષ મૃત્યુનું કારણ બને છે, જે એક નિયમનકારી પદ્ધતિ સૂચવે છે જેના દ્વારા ઉર્મોટોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ સાયટોસ્કેલેટલ માળખાઓની વિશાળ શ્રેણીને પ્રભાવિત કરે છે.
ઉર્બેનોનિક એસિડનું વધુ વિગતવાર વર્ણન ઉર્બેનોનિક એસિડની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિને વધુ સારી રીતે સમજવામાં મદદ કરશે. ખાસ કરીને, આગળનો ધ્યેય એ છે કે ઉર્સોનિક એસિડની ઘટાડેલા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સાથે જોડવાની ક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવું જેથી નક્કી કરી શકાય કે શું ઉર્સોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ સીધા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર કાર્ય કરે છે અને તેમને ડિપોલિમરાઇઝ કરે છે, અથવા તેમની ક્રિયા માઇક્રોટ્યુબ્યુલના અસ્થિરીકરણમાં પરિણમે છે. વધુમાં, જ્યાં સૂક્ષ્મટ્યુબ્યુલ્સ સીધો લક્ષ્ય નથી, ત્યાં છોડના કોષો પર ઉર્સોનિક એસિડના ક્રિયા સ્થળ અને પરમાણુ લક્ષ્યોને ઓળખવાથી સંબંધિત સંયોજનોના ગુણધર્મો અને હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિને સુધારવાની સંભવિત રીતોને વધુ સમજવામાં મદદ મળશે. અમારા બાયોએક્ટિવિટી પરીક્ષણે અરેબિડોપ્સિસ થલિયાના, તમાકુ અને લિવરવોર્ટ જેવા છોડના વિકાસ પર ઉર્સોનિક એસિડની અનન્ય સાયટોટોક્સિક ક્ષમતા જાહેર કરી, જ્યારે ઇ. કોલી કે હેલા કોષોને અસર થઈ ન હતી. જો ખુલ્લા કૃષિ ક્ષેત્રોમાં ઉપયોગ માટે હર્બિસાઇડ્સ તરીકે વિકસાવવામાં આવે તો પ્રાણી કોષો માટે ઓછી અથવા કોઈ ઝેરીતા નથી તે યુર્સોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝનો ફાયદો છે. ખરેખર, યુકેરીયોટ્સમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સામાન્ય રચના હોવાથી, છોડમાં તેમનો પસંદગીયુક્ત અવરોધ હર્બિસાઇડ્સ માટે મુખ્ય આવશ્યકતા છે. ઉદાહરણ તરીકે, પ્રોપાયઝામાઇડ, એક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટ જે ટ્યુબ્યુલિન સાથે સીધું જોડાય છે અને પોલિમરાઇઝેશનને અટકાવે છે, તેનો ઉપયોગ હર્બિસાઇડ તરીકે થાય છે કારણ કે તે પ્રાણી કોષો માટે ઓછી ઝેરી છે24. ડિસોપીરામાઇડથી વિપરીત, સંબંધિત બેન્ઝામાઇડ્સમાં વિવિધ લક્ષ્ય વિશિષ્ટતાઓ હોય છે. છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ ઉપરાંત, RH-4032 અથવા બેન્ઝોક્સામાઇડ અનુક્રમે પ્રાણી કોષો અથવા ઓમીસીટ્સના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને પણ અટકાવે છે, અને ઝાલીલામાઇડનો ઉપયોગ તેની ઓછી ફાયટોટોક્સિસિટી25,26,27 ને કારણે ફૂગનાશક તરીકે થાય છે. નવા શોધાયેલા રીંછ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ છોડ સામે પસંદગીયુક્ત સાયટોટોક્સિસિટી દર્શાવે છે, પરંતુ એ નોંધવું યોગ્ય છે કે વધુ ફેરફારો તેમની લક્ષ્ય વિશિષ્ટતામાં ફેરફાર કરી શકે છે, જે સંભવિત રીતે રોગકારક ફૂગ અથવા ઓમીસીટ્સના નિયંત્રણ માટે વધારાના ડેરિવેટિવ્ઝ પ્રદાન કરે છે.
ઉર્બેનોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝના અનન્ય ગુણધર્મો હર્બિસાઇડ્સ તરીકે તેમના વિકાસ અને સંશોધન સાધનો તરીકે ઉપયોગ માટે ઉપયોગી છે. છોડના કોષના આકારને નિયંત્રિત કરવામાં સાયટોસ્કેલેટનનું મહત્વ વ્યાપકપણે ઓળખાય છે. અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે છોડે મોર્ફોજેનેસિસને યોગ્ય રીતે નિયંત્રિત કરવા માટે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરીને કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સંગઠનની જટિલ પદ્ધતિઓ વિકસાવી છે. માઇક્રોટ્યુબ્યુલ પ્રવૃત્તિના નિયમન માટે જવાબદાર મોટી સંખ્યામાં અણુઓ ઓળખવામાં આવ્યા છે, અને સંબંધિત સંશોધન હજુ પણ ચાલુ છે3,4,28. છોડના કોષોમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાની અમારી વર્તમાન સમજ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સંગઠનની પદ્ધતિઓને સંપૂર્ણપણે સમજાવતી નથી. ઉદાહરણ તરીકે, જોકે ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરિઝાલિન બંને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને ડિપોલિમરાઇઝ કરી શકે છે, ડિસોપાયરામાઇડ ગંભીર મૂળ વિકૃતિનું કારણ બને છે જ્યારે ઓરિઝાલિન પ્રમાણમાં હળવી અસર ધરાવે છે. વધુમાં, ટ્યુબ્યુલિનમાં પરિવર્તન, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને સ્થિર કરે છે, તે મૂળમાં ડેક્સ્ટ્રોરોટેશનનું કારણ પણ બને છે, જ્યારે પેક્લિટેક્સેલ, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને પણ સ્થિર કરે છે, તે નથી કરતું. તેથી, ઉર્સોલિક એસિડના પરમાણુ લક્ષ્યોનો અભ્યાસ અને ઓળખ કરવાથી છોડના કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના નિયમનમાં નવી સમજ મળશે. તેવી જ રીતે, વિકૃત વૃદ્ધિને પ્રોત્સાહન આપવામાં અસરકારક રસાયણો, જેમ કે ડિસોપાયરામાઇડ, અને ઓછા અસરકારક રસાયણો, જેમ કે ઓરીઝાલિન અથવા કુમામોટોરિક એસિડ, ની ભવિષ્યની તુલના, વિકૃત વૃદ્ધિ કેવી રીતે થાય છે તેના સંકેતો પ્રદાન કરશે.
બીજી બાજુ, સંરક્ષણ-સંબંધિત સાયટોસ્કેલેટલ પુનઃરચનાઓ યુર્સોનિક એસિડની સાયટોટોક્સિસિટી સમજાવવા માટે બીજી શક્યતા છે. રોગકારકનો ચેપ અથવા છોડના કોષોમાં એલિસિટર દાખલ થવાથી ક્યારેક સાયટોસ્કેલેટનનો નાશ થાય છે અને ત્યારબાદ કોષ મૃત્યુ થાય છે29. ઉદાહરણ તરીકે, ઓમીસીટ-ઉત્પન્ન ક્રિપ્ટોક્સાન્થિન તમાકુ કોષ મૃત્યુ પહેલાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને વિક્ષેપિત કરે છે તે નોંધાયું છે, જે KAND સારવાર સાથે થાય છે30,31 જેવું જ છે. યુર્સોનિક એસિડ દ્વારા પ્રેરિત સંરક્ષણ પ્રતિભાવો અને સેલ્યુલર પ્રતિભાવો વચ્ચેની સમાનતાએ અમને એવી ધારણા તરફ દોરી કે તેઓ સામાન્ય સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓને ઉત્તેજિત કરે છે, જોકે ક્રિપ્ટોક્સાન્થિન કરતાં યુર્સોનિક એસિડની ઝડપી અને મજબૂત અસર સ્પષ્ટ છે. જો કે, અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સનું વિક્ષેપ સ્વયંભૂ કોષ મૃત્યુને પ્રોત્સાહન આપે છે, જે હંમેશા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ વિક્ષેપ સાથે નથી29. વધુમાં, તે જોવાનું બાકી છે કે શું રોગકારક અથવા એલિસિટર મૂળ વૃદ્ધિનું કારણ બને છે, જેમ કે યુર્સોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ કરે છે. આમ, સંરક્ષણ પ્રતિભાવો અને સાયટોસ્કેલેટનને જોડતું પરમાણુ જ્ઞાન એક આકર્ષક સમસ્યા છે જેને સંબોધિત કરવી જોઈએ. ઉર્સોનિક એસિડથી સંબંધિત ઓછા પરમાણુ વજનવાળા સંયોજનોની હાજરી, તેમજ વિવિધ ક્ષમતાઓ ધરાવતા ડેરિવેટિવ્ઝની શ્રેણીનો ઉપયોગ કરીને, તેઓ અજાણ્યા સેલ્યુલર મિકેનિઝમ્સને લક્ષ્ય બનાવવાની તકો પૂરી પાડી શકે છે.
એકસાથે, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરતા નવા સંયોજનોની શોધ અને ઉપયોગ છોડના કોષ આકાર નિર્ધારણ અંતર્ગત જટિલ પરમાણુ પદ્ધતિઓને સંબોધવા માટે શક્તિશાળી પદ્ધતિઓ પ્રદાન કરશે. આ સંદર્ભમાં, તાજેતરમાં વિકસિત સંયોજન ઉર્મોટોનિક એસિડ, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરે છે અને કોષ મૃત્યુને પ્રેરિત કરે છે, તે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ નિયંત્રણ અને આ અન્ય પદ્ધતિઓ વચ્ચેના જોડાણને સમજવાની તક પૂરી પાડી શકે છે. આમ, ઉર્બેનોનિક એસિડનો ઉપયોગ કરીને રાસાયણિક અને જૈવિક વિશ્લેષણ આપણને છોડના સાયટોસ્કેલેટનને નિયંત્રિત કરતી પરમાણુ નિયમનકારી પદ્ધતિઓને સમજવામાં મદદ કરશે.
S. werraensis MK493-CF1 ને 500 mL ના મૂંઝવણભર્યા Erlenmeyer ફ્લાસ્કમાં ઇનોક્યુલેટ કરો જેમાં 110 mL બીજ માધ્યમ હોય છે જેમાં 2% (w/v) ગેલેક્ટોઝ, 2% (w/v) એસેન્સ પેસ્ટ, 1% (w/v) બેક્ટો કમ્પોઝિશન હોય છે. -સોયટન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, ઇન્ક.), 0.5% (w/v) મકાઈનો અર્ક (KOGOSTCH કંપની લિમિટેડ, જાપાન), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 અને 0.2% CaCO3 ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં હોય છે. (pH 7.4 નસબંધી પહેલાં). બીજ કલ્ચરને રોટરી શેકર (180 rpm) પર 27°C પર 2 દિવસ માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. ઘન સ્થિતિ આથો દ્વારા ઉત્પાદન ખેતી. બીજ કલ્ચર (7 મિલી) ને 500 મિલી K-1 ફ્લાસ્કમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 40 ગ્રામ ઉત્પાદન માધ્યમ હતું જેમાં 15 ગ્રામ દબાયેલ જવ (MUSO Co., Ltd., જાપાન) અને 25 ગ્રામ ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી (pH ને sterilization પહેલાં સમાયોજિત કરવામાં આવ્યું ન હતું) હતું. આથો 14 દિવસ માટે અંધારામાં 30°C પર હાથ ધરવામાં આવ્યો હતો. આથો સામગ્રીને 40 મિલી/બોટલ EtOH સાથે કાઢવામાં આવી હતી અને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવી હતી (1500 ગ્રામ, 4°C, 10 મિનિટ). કલ્ચર સુપરનેટન્ટ (60 મિલી) 10% MeOH/EtOAc ના મિશ્રણ સાથે કાઢવામાં આવી હતી. કાર્બનિક સ્તરને ઓછા દબાણ હેઠળ બાષ્પીભવન કરીને અવશેષ (59.5 મિલિગ્રામ) મેળવવામાં આવ્યું હતું, જેને રિવર્સ ફેઝ કોલમ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × લંબાઈ 250 mm) પર ગ્રેડિયન્ટ એલ્યુશન (0-10 મિનિટ: 90%) સાથે HPLC હેઠળ મૂકવામાં આવ્યું હતું. H2O/CH3CN, 10-35 મિનિટ: 90% H2O/CH3CN થી 70% H2O/CH3CN (ગ્રેડિયન્ટ), 35-45 મિનિટ: 90% H2O/EtOH, 45-155 મિનિટ: 90% H2O/EtOH થી 100% EtOH (ગ્રેડિયન્ટ (ગ્રેડિયન્ટ), 155-200 મિનિટ: 100% EtOH) 1.5 મિલી/મિનિટના પ્રવાહ દરે, કુમામોનામાઇડ (1, 36.0 મિલિગ્રામ) ને સફેદ આકારહીન પાવડર તરીકે અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.
કુમામોટોએમાઇડ(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ગણતરી કરેલ મૂલ્ય: 141.0659, માપેલ મૂલ્ય: 141.0663, IR νમહત્તમ 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
કોલંબિયા બીજ (કોલ-0) સંશોધન ઉપયોગ માટે પરવાનગી સાથે અરેબિડોપ્સિસ બાયોલોજિકલ રિસોર્સ સેન્ટર (ABRC) માંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. અરેબિડોપ્સિસ બીજનો પ્રચાર અને જાળવણી અમારી પ્રયોગશાળાની પરિસ્થિતિઓમાં કરવામાં આવી હતી અને જંગલી પ્રકારના અરેબિડોપ્સિસ છોડ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાયો હતો. અરેબિડોપ્સિસ બીજને સપાટી પર જંતુરહિત કરવામાં આવ્યા હતા અને અડધા-શક્તિવાળા મુરાશિગે અને સ્કૂગ માધ્યમમાં 2% સુક્રોઝ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ), 0.05% (w/v) 2-(4-મોર્ફોલિનો) ઇથેનેસલ્ફોનિક એસિડ (MES) (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) અને 1.5% અગર (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ), pH 5.7, 23 °C અને સતત પ્રકાશ પર ધરાવતા હતા. phs1-1 મ્યુટન્ટના બીજ ટી. હાશિમોટો (નારા ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ સાયન્સ એન્ડ ટેકનોલોજી) દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા.
ટી. હાશિમોટો (નારા ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ સાયન્સ એન્ડ ટેકનોલોજી) દ્વારા સ્ટ્રેન SR-1 ના બીજ પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા અને જંગલી પ્રકારના તમાકુના છોડ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાયા હતા. તમાકુના બીજને સપાટી પર જંતુરહિત કરવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરણને પ્રોત્સાહન આપવા માટે ત્રણ રાત માટે જંતુરહિત પાણીમાં પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા, પછી pH 5.7 સાથે 2% સુક્રોઝ, 0.05% (w/v) MES, અને 0.8% ગેલન ગમ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) મુરાશિગે. અને સ્કૂગ માધ્યમ ધરાવતા અર્ધ-શક્તિવાળા દ્રાવણમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને સતત પ્રકાશ હેઠળ 23°C પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.
સ્ટ્રેન ટાક-1 ટી. કોહચી (ક્યોટો યુનિવર્સિટી) દ્વારા પ્રદાન કરવામાં આવ્યું હતું અને તેનો ઉપયોગ લિવરવોર્ટ અભ્યાસ માટે પ્રમાણભૂત પ્રાયોગિક એકમ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. જેમ્મા વંધ્યીકૃત સંવર્ધિત છોડમાંથી મેળવવામાં આવ્યું હતું અને પછી ગેમ્બોર્ગ B5 માધ્યમ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) પર પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 1% સુક્રોઝ અને 0.3% ગેલન ગમ હતું અને સતત પ્રકાશ હેઠળ 23°C પર ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.
ટોબેકો BY-2 કોષો (નિકોટિઆના ટેબેકમ L. cv. બ્રાઇટ યલો 2) એસ. હાસેઝાવા (યુનિવર્સિટી ઓફ ટોક્યો) દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા. BY-2 કોષોને સંશોધિત લિન્સમીયર અને સ્કૂગ માધ્યમમાં 95 ગણો પાતળો કરવામાં આવ્યો હતો અને સાપ્તાહિક 2,4-ડાયક્લોરોફેનોક્સાયસેટિક એસિડ 32 સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા. કોષ સસ્પેન્શનને રોટરી શેકર પર 130 rpm પર અંધારામાં 27°C પર મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. તાજા માધ્યમના 10 ગણા વોલ્યુમથી કોષોને ધોઈ લો અને તે જ માધ્યમમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. કોબીજ મોઝેક વાયરસ 35S પ્રમોટર હેઠળ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ માર્કર TagRFP-TUA6 અથવા એક્ટિન ફિલામેન્ટ માર્કર GFP-ABD2 ને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરતી BY-2 ટ્રાન્સજેનિક કોષ રેખાઓ વર્ણવ્યા મુજબ 33,34,35 ઉત્પન્ન થઈ હતી. આ કોષ રેખાઓ મૂળ BY-2 સેલ લાઇન માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પ્રક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરીને જાળવી અને સમન્વયિત કરી શકાય છે.
હેલા કોષોને ડલ્બેકોના સંશોધિત ઇગલના માધ્યમ (DMEM) (લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) માં 10% ફેટલ બોવાઇન સીરમ, 1.2 U/ml પેનિસિલિન અને 1.2 μg/ml સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન સાથે 37°C તાપમાને 5% CO2 સાથે ઇન્ક્યુબેટરમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા.
આ હસ્તપ્રતમાં વર્ણવેલ બધા પ્રયોગો જાપાનીઝ બાયોસેફ્ટી નિયમો અને માર્ગદર્શિકા અનુસાર કરવામાં આવ્યા હતા.
સંયોજનોને સ્ટોક સોલ્યુશન તરીકે ડાયમિથાઈલ સલ્ફોક્સાઇડ (DMSO; ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) માં ઓગાળવામાં આવ્યા હતા અને એરેબિડોપ્સિસ અને તમાકુ માટે MS માધ્યમમાં અથવા લિવરવોર્ટ માટે ગેમ્બોર્ગ B5 માધ્યમમાં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. મૂળ વૃદ્ધિ અવરોધ પરીક્ષણ માટે, સૂચવેલ સંયોજનો અથવા DMSO ધરાવતા અગર માધ્યમ પર પ્લેટ દીઠ 10 થી વધુ બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા. બીજને 7 દિવસ માટે વૃદ્ધિ ચેમ્બરમાં ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. રોપાઓનો ફોટોગ્રાફ લેવામાં આવ્યો હતો અને મૂળની લંબાઈ માપવામાં આવી હતી. એરેબિડોપ્સિસ અંકુરણ પરીક્ષણ માટે, 200 μM સંયોજન અથવા DMSO ધરાવતા અગર માધ્યમ પર પ્લેટ દીઠ 48 બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા. એરેબિડોપ્સિસ બીજ વૃદ્ધિ ચેમ્બરમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરણ પામેલા રોપાઓની સંખ્યા અંકુરણ (ડેગ) ના 7 દિવસ પછી ગણવામાં આવી હતી. તમાકુ અંકુરણ પરીક્ષણ માટે, 200 μM KAND અથવા DMSO ધરાવતા અગર માધ્યમ પર પ્લેટ દીઠ 24 બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા. તમાકુના બીજ વૃદ્ધિ ચેમ્બરમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરણ પામેલા રોપાઓની સંખ્યા 14 દિવસ પછી ગણવામાં આવી હતી. લિવરવોર્ટ વૃદ્ધિ અવરોધ પરીક્ષણ માટે, દરેક પ્લેટમાંથી 9 ગર્ભને KAND અથવા DMSO ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા ધરાવતા અગર માધ્યમ પર પ્લેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને 14 દિવસ માટે વૃદ્ધિ ચેમ્બરમાં સેવન કરવામાં આવ્યા હતા.
મૂળ મેરિસ્ટેમ સંગઠનની કલ્પના કરવા માટે 5 મિલિગ્રામ/મિલી પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ (PI) થી રંગાયેલા રોપાઓનો ઉપયોગ કરો. TCS SPE કોન્ફોકલ લેસર સ્કેનીંગ માઇક્રોસ્કોપ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા PI સિગ્નલોનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું.
માલામી અને બેનફે36 દ્વારા વર્ણવેલ પ્રોટોકોલ અનુસાર β-ગ્લુકુરોનિડેઝ (GUS) સાથે મૂળનું હિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. રોપાઓને રાતોરાત 90% એસીટોનમાં ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા, 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid સાથે GUS બફરમાં 1 કલાક માટે સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા અને હાઇડ્રેટેડ ક્લોરાલ્ડીહાઇડ દ્રાવણમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા. (8 ગ્રામ ક્લોરલ હાઇડ્રેટ, 2 મિલી પાણી અને 1 મિલી ગ્લિસરોલ) અને એક્સિયો ઇમેજર M1 માઇક્રોસ્કોપ (કાર્લ ઝીસ) નો ઉપયોગ કરીને ડિફરન્શિયલ ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.
ઊભી પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા 7 દિવસના રોપાઓ પર મૂળના ખૂણા માપવામાં આવ્યા હતા. પગલા 6 માં વર્ણવ્યા મુજબ ગુરુત્વાકર્ષણ વેક્ટરની દિશાથી મૂળના ખૂણાને માપો.
કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સની ગોઠવણી વર્ણવ્યા મુજબ જોવા મળી હતી, પ્રોટોકોલ 37 માં નાના ફેરફારો સાથે. એન્ટિ-β-ટ્યુબ્યુલિન એન્ટિબોડી (KMX-1, મર્ક મિલિપોર: MAB3408) અને એલેક્સા ફ્લોર 488-કન્જુગેટેડ એન્ટિ-માઉસ IgG (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક: A32723) નો ઉપયોગ અનુક્રમે 1:1000 અને 1:100 ડિલ્યુશન પર પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. TCS SPE કોન્ફોકલ લેસર સ્કેનીંગ માઇક્રોસ્કોપ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર Z-સ્ટેક છબીઓ મેળવો અને મહત્તમ તીવ્રતા અંદાજો બનાવો.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર સેલ કાઉન્ટિંગ કિટ 8 (ડોજિંડો) નો ઉપયોગ કરીને HeLa કોષ પ્રસાર પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
600 nm (OD600) પર સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને કલ્ચરમાં કોષ ઘનતા માપીને E. coli DH5α ની વૃદ્ધિનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું.
CSU-X1 કોન્ફોકલ સ્કેનિંગ ડિવાઇસ (યોકોગાવા) અને sCMOS કેમેરા (ઝાયલા, એન્ડોર ટેકનોલોજી) થી સજ્જ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને ટ્રાન્સજેનિક BY-2 કોષોમાં સાયટોસ્કેલેટલ સંગઠનનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું. છબી વિશ્લેષણ દ્વારા સાયટોસ્કેલેટલ ઘનતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું, જેણે 38,39 વર્ણવ્યા મુજબ ImageJ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કોન્ફોકલ છબીઓમાં સાયટોપ્લાઝમિક પિક્સેલ્સમાં સાયટોસ્કેલેટલ પિક્સેલ્સની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું હતું.
BY-2 કોષોમાં કોષ મૃત્યુ શોધવા માટે, કોષ સસ્પેન્શનના એક અંશને ઓરડાના તાપમાને 0.05% ઇવાન્સ બ્લુ સાથે 10 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું. મૃત કોષોનું પસંદગીયુક્ત ઇવાન્સ બ્લુ સ્ટેનિંગ અકબંધ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન40 દ્વારા સધ્ધર કોષોમાંથી રંગના બહાર કાઢવા પર આધાર રાખે છે. તેજસ્વી-ક્ષેત્ર માઇક્રોસ્કોપ (BX53, ઓલિમ્પસ) નો ઉપયોગ કરીને રંગીન કોષોનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.
HeLa કોષોને 37°C તાપમાને ભેજયુક્ત ઇન્ક્યુબેટરમાં 10% FBS અને 5% CO2 સાથે પૂરક DMEM માં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. કોષોને 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colsemid (Gibco), અથવા 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) સાથે 37°C તાપમાને 6 કલાક માટે સારવાર આપવામાં આવી હતી. કોષોને MetOH સાથે 10 મિનિટ માટે અને પછી ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે એસિટેટ સાથે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા. ફિક્સ્ડ કોષોને β-ટ્યુબ્યુલિન પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (1D4A4, પ્રોટીનટેક: 66240-1) સાથે 0.5% BSA/PBS માં 2 કલાક માટે ઓગાળવામાં આવ્યા હતા, TBST સાથે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પછી Alexa Fluor બકરી એન્ટિબોડી સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. 488 1 કલાક. – માઉસ IgG (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક: A11001) અને 15 ng/ml 4′,6-ડાયમિડિનો-2-ફેનાઇલિંડોલ (DAPI) 0.5% BSA/PBS માં ભેળવવામાં આવ્યા હતા. TBST થી ત્રણ વખત ધોવા પછી, Nikon Eclipse Ti-E ઇન્વર્ટેડ માઇક્રોસ્કોપ પર સ્ટેઇન્ડ કોષો જોવા મળ્યા. મેટામોર્ફ સોફ્ટવેર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) નો ઉપયોગ કરીને ઠંડા હમામાત્સુ ORCA-R2 CCD કેમેરા વડે છબીઓ કેપ્ચર કરવામાં આવી હતી.