છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરતા નવલકથા છોડ વૃદ્ધિ અવરોધકો તરીકે ઉર્સા મોનોમાઇડ્સની શોધ, લાક્ષણિકતા અને કાર્યાત્મક સુધારણા.

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે બ્રાઉઝરનાં વર્ઝનમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે.શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે તમારા બ્રાઉઝરના નવા સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે સ્ટાઇલ અથવા JavaScript વિના સાઇટ બતાવી રહ્યા છીએ.
કુદરતી ઉત્પાદનોની શોધ અને ફાયદાકારક ઉપયોગ માનવ જીવનને સુધારવામાં મદદ કરી શકે છે.નીંદણને અંકુશમાં લેવા માટે વનસ્પતિ વૃદ્ધિ અવરોધક રસાયણોનો હર્બિસાઇડ્સ તરીકે વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.વિવિધ પ્રકારના હર્બિસાઇડ્સનો ઉપયોગ કરવાની જરૂરિયાતને કારણે, ક્રિયાની નવી પદ્ધતિઓ સાથે સંયોજનોને ઓળખવાની જરૂર છે.આ અભ્યાસમાં, અમે Streptomyces werraensis MK493-CF1 માંથી નવલકથા N -alkoxypyrrole કમ્પાઉન્ડ, coumamonamide શોધ્યું અને સંપૂર્ણ સંશ્લેષણ પ્રક્રિયા સ્થાપિત કરી.જૈવિક પ્રવૃત્તિના અભ્યાસ દ્વારા, અમે શોધ્યું કે ઉર્સ-મોનોએમિક એસિડ એ ઉર્સ-મોનોઆમાઇડનું કૃત્રિમ મધ્યવર્તી છે અને સંભવિતછોડ વૃદ્ધિ અવરોધક.વધુમાં, અમે urbenyloxy ડેરિવેટિવ (UDA) સહિત વિવિધ urbenonic acid ડેરિવેટિવ્સ વિકસાવ્યા છે, જે HeLa કોષોના વિકાસને નકારાત્મક અસર કર્યા વિના ઉચ્ચ હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.અમે એ પણ જોયું કે urmotonic એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને વિક્ષેપિત કરે છે;વધુમાં, KAND એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરે છે અને કોષ મૃત્યુને પ્રેરિત કરે છે;આ બહુપક્ષીય અસરો જાણીતા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકોથી અલગ છે અને યુર્સોનિક એસિડ માટે ક્રિયાની નવી પદ્ધતિ સૂચવે છે, જે નવા હર્બિસાઇડ્સના વિકાસમાં એક મહત્વપૂર્ણ ફાયદો દર્શાવે છે.
ફાયદાકારક કુદરતી ઉત્પાદનો અને તેમના ડેરિવેટિવ્ઝની શોધ અને વ્યવહારિક ઉપયોગ એ માનવ જીવનની ગુણવત્તા સુધારવાનું એક માધ્યમ છે.સુક્ષ્મસજીવો, છોડ અને જંતુઓ દ્વારા ઉત્પાદિત ગૌણ ચયાપચયને કારણે દવા અને કૃષિમાં મોટી પ્રગતિ થઈ છે.કુદરતી ઉત્પાદનોમાંથી ઘણી એન્ટિબાયોટિક્સ અને લ્યુકેમિયા વિરોધી દવાઓ વિકસાવવામાં આવી છે.વધુમાં, વિવિધ પ્રકારનાજંતુનાશકો, ફૂગનાશકો અને હર્બિસાઇડ્સ કૃષિમાં ઉપયોગ માટે આ કુદરતી ઉત્પાદનોમાંથી કાઢવામાં આવે છે.ખાસ કરીને, નીંદણ નિયંત્રણ હર્બિસાઇડ્સ એ આધુનિક કૃષિમાં પાકની ઉપજ વધારવા માટેના મહત્વપૂર્ણ સાધનો છે, અને વિવિધ પ્રકારના સંયોજનો પહેલેથી જ વ્યાવસાયિક રીતે ઉપયોગમાં લેવાય છે.છોડમાં થતી કેટલીક સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓ, જેમ કે પ્રકાશસંશ્લેષણ, એમિનો એસિડ ચયાપચય, કોષ દિવાલ સંશ્લેષણ, મિટોસિસનું નિયમન, ફાયટોહોર્મોન સિગ્નલિંગ અથવા પ્રોટીન સંશ્લેષણ, હર્બિસાઇડ્સના લાક્ષણિક લક્ષ્યો માનવામાં આવે છે.સંયોજનો જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ફંક્શનને અવરોધે છે તે હર્બિસાઇડ્સનો એક સામાન્ય વર્ગ છે જે મિટોટિક નિયમન2ને અસર કરીને છોડના વિકાસને અસર કરે છે.
માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સાયટોસ્કેલેટનના ઘટકો છે અને યુકેરીયોટિક કોષોમાં વ્યાપકપણે સાચવવામાં આવે છે.ટ્યુબ્યુલિન હેટરોડીમરમાં α-ટ્યુબ્યુલિન અને β-ટ્યુબ્યુલિન રચાય છે જે રેખીય માઇક્રોટ્યુબ્યુલ પ્રોટોફિલામેન્ટ્સ ધરાવે છે, જેમાં 13 પ્રોટોફિલામેન્ટ્સ નળાકાર માળખું બનાવે છે.માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ છોડના કોષોમાં બહુવિધ ભૂમિકાઓ ભજવે છે, જેમાં કોષનો આકાર, કોષ વિભાજન અને અંતઃકોશિક પરિવહનનો સમાવેશ થાય છે3,4.પ્લાન્ટ કોશિકાઓમાં ઇન્ટરફેસ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનની નીચે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ હોય છે, અને આ કહેવાતા કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સેલ્યુલોઝ સિન્થેઝ કોમ્પ્લેક્સ 4,5 ના નિયમન દ્વારા સેલ્યુલોઝ માઇક્રોફિબ્રિલ્સના સંગઠનને નિયંત્રિત કરવા માટે માનવામાં આવે છે.રુટ એપિડર્મલ કોશિકાઓના કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ, જે મૂળની ટોચના ઝડપી વિસ્તરણના ક્ષેત્રમાં હાજર છે, તે બાજુમાં સ્થિત છે, અને સેલ્યુલોઝ માઇક્રોફાઇબર્સ આ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અનુસરે છે અને કોષના વિસ્તરણની દિશાને મર્યાદિત કરે છે, જેનાથી એનિસોટ્રોપિક કોષના વિસ્તરણને પ્રોત્સાહન મળે છે.તેથી, માઇક્રોટ્યુબ્યુલનું કાર્ય પ્લાન્ટ મોર્ફોલોજી સાથે નજીકથી સંબંધિત છે.જીન્સ એન્કોડિંગ ટ્યુબ્યુલિનમાં એમિનો એસિડ અવેજીના કારણે કોર્ટીકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ એરે અને અરેબીડોપ્સિસ 6,7 માં ડાબી અથવા જમણી બાજુની વૃદ્ધિ થાય છે.તેવી જ રીતે, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-સંબંધિત પ્રોટીનમાં પરિવર્તન કે જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરે છે તે પણ વિકૃત મૂળ વૃદ્ધિ 8,9,10,11,12,13 તરફ દોરી શકે છે.વધુમાં, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-વિક્ષેપ પાડતા હર્બિસાઇડ્સ જેમ કે ડિસોપાયરામાઇડ, જેને પ્રિટીલાક્લોર તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, સાથેની સારવાર પણ ડાબી બાજુના ત્રાંસી મૂળની વૃદ્ધિનું કારણ બને છે14.આ ડેટા સૂચવે છે કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ કાર્યનું ચોક્કસ નિયમન છોડની વૃદ્ધિની દિશા નક્કી કરવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે.
વિવિધ પ્રકારના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકોની શોધ કરવામાં આવી છે, અને આ દવાઓએ સાયટોસ્કેલેટલ સંશોધન તેમજ કૃષિ અને દવા2માં નોંધપાત્ર યોગદાન આપ્યું છે.ખાસ કરીને, ઓરીઝાલિન, ડિનિટ્રોએનિલિન સંયોજનો, ડિસોપાયરામાઇડ, બેન્ઝામાઇડ-સંબંધિત સંયોજનો અને તેમના એનાલોગ માઇક્રોટ્યુબ્યુલના કાર્યને અટકાવી શકે છે અને તેથી છોડના વિકાસને અટકાવે છે.તેથી, તેઓ હર્બિસાઇડ્સ તરીકે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે.જો કે, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ એ વનસ્પતિ અને પ્રાણી કોષોનો એક મહત્વપૂર્ણ ઘટક હોવાથી, મોટાભાગના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો બંને પ્રકારના કોષો માટે સાયટોટોક્સિક હોય છે.તેથી, હર્બિસાઇડ્સ તરીકે તેમની માન્ય ઉપયોગિતા હોવા છતાં, મર્યાદિત સંખ્યામાં એન્ટિમાઇક્રોટ્યુબ્યુલ એજન્ટોનો વ્યવહારિક હેતુઓ માટે ઉપયોગ થાય છે.
સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ એ સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ પરિવારની એક જીનસ છે, જેમાં એરોબિક, ગ્રામ-પોઝિટિવ, ફિલામેન્ટસ બેક્ટેરિયાનો સમાવેશ થાય છે અને તે ગૌણ ચયાપચયની વિશાળ શ્રેણી ઉત્પન્ન કરવાની ક્ષમતા માટે વ્યાપકપણે જાણીતા છે.તેથી, તે નવા જૈવિક રીતે સક્રિય કુદરતી ઉત્પાદનોના સૌથી મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોતોમાંનું એક માનવામાં આવે છે.વર્તમાન અભ્યાસમાં, અમે કૂમામોનામાઇડ નામનું એક નવું સંયોજન શોધી કાઢ્યું હતું, જે સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ વેરેન્સિસ MK493-CF1 અને S. werraensis ISP 5486 માંથી અલગ હતું. વર્ણપટ વિશ્લેષણ અને સંપૂર્ણ સ્પેક્ટ્રલ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને, coumamonamide નું માળખું લાક્ષણિકતા અને તેના અનન્ય N-N-N-N-N-SQL ની રચનાને ઓળખવામાં આવી હતી. નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.સંશ્લેષણઉર્સમોનિક એસિડ, ઉર્સમોનોમાઇડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝનું કૃત્રિમ મધ્યવર્તી, લોકપ્રિય મોડેલ પ્લાન્ટ અરેબિડોપ્સિસ થલિયાનાના વિકાસ અને અંકુરણને અટકાવતું જોવા મળ્યું હતું.સ્ટ્રક્ચર-એક્ટિવિટી રિલેશનશિપ સ્ટડીમાં, અમે જોયું કે C9 સાથેનું સંયોજન અર્સોનિક એસિડમાં ફેરફાર કરે છે, જેને નોનાયલોક્સી ડેરિવેટિવ ઑફ ursonic acid (KAND) કહેવાય છે, જે વૃદ્ધિ અને અંકુરણ પર અવરોધક અસરને નોંધપાત્ર રીતે વધારે છે.નોંધનીય રીતે, નવા શોધાયેલ છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક તમાકુ અને લીવરવૉર્ટના વિકાસને પણ અસર કરે છે અને તે બેક્ટેરિયા અથવા હેલા કોષો માટે સાયટોટોક્સિક નથી.તદુપરાંત, કેટલાક અર્મોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્સ વિકૃત મૂળ ફેનોટાઇપને પ્રેરિત કરે છે, જે સૂચવે છે કે આ ડેરિવેટિવ્સ સીધી કે પરોક્ષ રીતે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરે છે.આ વિચાર સાથે સુસંગત, ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ અથવા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન સાથે લેબલવાળા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના અમારા અવલોકનો સૂચવે છે કે KAND સારવાર માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને ડિપોલિમરાઇઝ કરે છે.વધુમાં, કુમામોટોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ સાથેની સારવારથી એક્ટિન માઇક્રોફિલામેન્ટ્સમાં વિક્ષેપ પડ્યો.આમ, અમે એક નવું છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક શોધી કાઢ્યું છે જેની ક્રિયાની અનન્ય પદ્ધતિમાં સાયટોસ્કેલેટનનો વિનાશ સામેલ છે.
MK493-CF1 તાણ શિનાગાવા-કુ, ટોક્યોમાં માટીથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.MK493-CF1 સ્ટ્રેઈન સારી રીતે ડાળીઓવાળું સ્ટ્રોમલ માયસેલિયમ બનાવે છે.16S રિબોસોમલ RNA જનીન (1422 bp)નો આંશિક ક્રમ નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યો હતો.આ તાણ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: લાક્ષણિક તાણ, 99.93%) જેવું જ છે.આ પરિણામના આધારે, તે નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું કે આ તાણ S. werraensis ના પ્રકાર તાણ સાથે નજીકથી સંબંધિત છે.તેથી, અમે આ તાણને કામચલાઉ નામ આપ્યું છે S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T પણ સમાન બાયોએક્ટિવ સંયોજનો ઉત્પન્ન કરે છે.આ સુક્ષ્મસજીવોમાંથી પ્રાકૃતિક ઉત્પાદનો મેળવવામાં શરૂઆતમાં થોડું સંશોધન થયું હોવાથી, વધુ રાસાયણિક સંશોધન હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.S. werraensis MK493-CF1 ની ખેતી 14 દિવસ માટે 30°C પર ઘન-સ્થિતિ આથો દ્વારા જવ માધ્યમ પર કર્યા પછી, માધ્યમ 50% EtOH સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું.59.5 મિલિગ્રામ ક્રૂડ અર્ક મેળવવા માટે 60 મિલી સેમ્પલને સૂકવવામાં આવ્યું હતું.N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, નામનું coumamonamide, 36.0 mg) આપવા માટે ક્રૂડ અર્ક રિવર્સ ફેઝ HPLC ને આધિન હતો.1 ની કુલ રકમ ક્રૂડ અર્કના આશરે 60% છે.તેથી, અમે કુમામોટોમાઇડ 1 ના ગુણધર્મોનો વિગતવાર અભ્યાસ કરવાનું નક્કી કર્યું.
કુમામોનામાઇડ 1 એ સફેદ આકારહીન પાવડર છે અને ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (HRESIMS) C6H8N2O2 (ફિગ. 1) ની પુષ્ટિ કરે છે.આ સંયોજનનો C2-અવેજી પાયરોલ ટુકડો δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR સ્પેક્ટ્રમમાં: 4.5 Hz દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે. , H-5) અને δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), અને 13C NMR સ્પેક્ટ્રમ ચાર sp2 કાર્બન અણુઓની હાજરી દર્શાવે છે.C2 સ્થાન પર એમાઈડ જૂથની હાજરીનું મૂલ્યાંકન δC 161.1 પર C-3 પ્રોટોનથી એમાઈડ કાર્બોનિલ કાર્બન સાથેના HMBC સહસંબંધ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું.વધુમાં, δH 4.10 (3H, S) અને δC 68.3 પર 1 H અને 13 C NMR શિખરો પરમાણુમાં N-methoxy જૂથોની હાજરી સૂચવે છે.જોકે મેથોક્સી જૂથની સાચી સ્થિતિ હજુ સુધી સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક વિશ્લેષણ જેમ કે ઉન્નત તફાવત સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી અને ન્યુક્લિયર ઓવરહાઉઝર સંક્ષિપ્ત (NOEDF) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવી ન હતી, તેમ છતાં, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide પ્રથમ ઉમેદવાર સંયોજન બન્યું.
1 ની સાચી રચના નક્કી કરવા માટે, કુલ સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું (ફિગ. 2a).એમ-સીપીબીએ સાથે વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ 2-એમિનોપાયરિડિન 2 ની સારવારના પરિણામે અનુરૂપ N-ઓક્સાઇડ 3 જથ્થાત્મક ઉપજમાં પરિણમ્યું.2 ના 2-એમિનોએઝિડેશન પછી, એબ્રામોવિચ દ્વારા વર્ણવેલ સાયક્લોકોન્ડેન્સેશન પ્રતિક્રિયા બેન્ઝીનમાં 90°C પર ગ્રામમાં ઇચ્છિત 1-હાઈડ્રોક્સી-1H-પાયરોલ-2-કાર્બોનિટ્રિલ 5 મેળવવા માટે હાથ ધરવામાં આવી હતી.ઝડપ 60% (બે તબક્કા).15,16 છે.4 ના મેથિલેશન અને હાઇડ્રોલિસિસ પછી સારી ઉપજ (70%, બે પગલાં) માં 1-મેથોક્સી-1એચ-પાયરોલ-2-કાર્બોક્સિલિક એસિડ (જેને “ક્યુમોટોનિક એસિડ”, 6 કહેવાય છે) આપ્યું.અંતે, જલીય એમોનિયાનો ઉપયોગ કરીને એસિડ ક્લોરાઇડ મધ્યવર્તી 6 દ્વારા એમિડેશનથી કુમામોટો એમાઈડ 1 માં 98% ઉપજ મળે છે.સંશ્લેષિત 1 ના તમામ સ્પેક્ટ્રલ ડેટા અલગ 1 જેવા જ હતા, તેથી 1 ની રચના નક્કી કરવામાં આવી હતી;
urbenamide અને urbenic acid ની જૈવિક પ્રવૃત્તિનું સામાન્ય સંશ્લેષણ અને વિશ્લેષણ.(a) કુમામોટો એમાઈડનું કુલ સંશ્લેષણ.(b) સાત દિવસ જૂના જંગલી પ્રકારના અરેબિડોપ્સિસ કોલંબિયા (કોલ) રોપાઓ મુરાશિગે અને સ્કૂગ (એમએસ) પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા જેમાં કુમામોનામાઇડ 6 અથવા કુમામોનામાઇડ 1 દર્શાવેલ સાંદ્રતા પર છે.સ્કેલ બાર = 1 સે.મી.
પ્રથમ, અમે છોડના વિકાસને મોડ્યુલેટ કરવાની તેમની ક્ષમતા માટે urbenamide અને તેના મધ્યવર્તી પદાર્થોની જૈવિક પ્રવૃત્તિઓનું મૂલ્યાંકન કર્યું.અમે એમએસ અગર માધ્યમમાં અર્સમોનામાઇડ 1 અથવા ઉર્સમોનિક એસિડ 6 ની વિવિધ સાંદ્રતા ઉમેરી અને આ માધ્યમ પર સંવર્ધિત અરેબિડોપ્સિસ થલિયાના રોપાઓ.આ પરીક્ષણો દર્શાવે છે કે 6 ની ઊંચી સાંદ્રતા (500 μM) મૂળ વૃદ્ધિને અવરોધે છે (ફિગ. 2b).આગળ, અમે 6 ની N1 પોઝિશનને બદલીને વિવિધ ડેરિવેટિવ્સ જનરેટ કર્યા અને તેમના પર સ્ટ્રક્ચર-એક્ટિવિટી રિલેશનશિપ સ્ટડીઝ કર્યા (એનાલોગ સિન્થેસિસ પ્રક્રિયાનું વર્ણન સપોર્ટિંગ ઇન્ફર્મેશન (SI) માં કરવામાં આવ્યું છે).અરેબિડોપ્સિસના રોપાઓ 50 μM યુર્સોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્સ ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા, અને મૂળની લંબાઈ માપવામાં આવી હતી.જેમ કે તે ચિત્રમાં દર્શાવેલ છે.આકૃતિ 3a, b, અને S1 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, કુમામો એસિડમાં N1 સ્થાન પર રેખીય અલ્કોક્સી સાંકળો (9, 10, 11, 12 અને 13) અથવા મોટી અલ્કોક્સી સાંકળો (15, 16, અને 17)ની વિવિધ લંબાઈ હોય છે.ડેરિવેટિવ્ઝે મૂળ વૃદ્ધિમાં નોંધપાત્ર અવરોધ દર્શાવ્યો હતો.વધુમાં, અમને જાણવા મળ્યું કે 200 μM 10, 11, અથવા 17 અંકુરણને અવરોધે છે (ફિગ. 3c અને S2).
કુમામોટો એમાઈડ અને સંબંધિત સંયોજનોના બંધારણ-પ્રવૃત્તિ સંબંધનો અભ્યાસ.(a) એનાલોગનું માળખું અને સંશ્લેષણ યોજના.(b) 50 μM કુમામોનામાઇડ ડેરિવેટિવ્ઝ સાથે અથવા તેના વગર MS માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા 7-દિવસ જૂના રોપાઓની મૂળ લંબાઈનું પ્રમાણીકરણ.ફૂદડીઓ શેમ ટ્રીટમેન્ટ સાથે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે (ટી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).n>18. ડેટા સરેરાશ ± SD તરીકે બતાવવામાં આવે છે.nt નો અર્થ છે "પરીક્ષણ કરેલ નથી" કારણ કે 50% થી વધુ બીજ અંકુરિત થયા નથી.(c) 200 μM કૌમામોનામાઇડ અને સંબંધિત સંયોજનો સાથે અથવા તેના વગર MS માધ્યમમાં 7 દિવસ સુધી ઉકાળવામાં આવેલ સારવાર કરેલ બીજના અંકુરણ દરનું પ્રમાણીકરણ.ફૂદડી શામ સારવાર (ચી-સ્ક્વેર ટેસ્ટ) સાથે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે.n=96.
રસપ્રદ વાત એ છે કે, C9 કરતાં વધુ લાંબી અલ્કાઈલ સાઇડ ચેઇનના ઉમેરાથી અવરોધક પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો થયો છે, જે સૂચવે છે કે કુમામોટોઇક એસિડ-સંબંધિત સંયોજનોને તેમની જૈવિક પ્રવૃત્તિ પ્રદર્શિત કરવા માટે ચોક્કસ કદની બાજુની સાંકળોની જરૂર પડે છે.
કારણ કે માળખું-પ્રવૃત્તિ સંબંધ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે C9 ને ursonic acid માં સંશોધિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ursonic acid (ત્યારબાદ KAND 11 તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) નો નોનૉલોક્સી ડેરિવેટિવ સૌથી અસરકારક છોડ વૃદ્ધિ અવરોધક હતો, અમે KAND 11 નું વધુ વિગતવાર વર્ણન હાથ ધર્યું. અરેબિડોપ્સિસની સારવાર 50 μM સાથે KAND 11 લગભગ સંપૂર્ણપણે અંકુરણને અટકાવે છે, જ્યારે KAND 11 ની ઓછી સાંદ્રતા (40, 30, 20, અથવા 10 μM) ડોઝ-આશ્રિત રીતે મૂળ વૃદ્ધિને અટકાવે છે (ફિગ. 4a, b).KAND 11 રુટ મેરિસ્ટેમ સદ્ધરતાને અસર કરે છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે પ્રોપીડિયમ આયોડાઈડ (PI) થી રંગાયેલા રુટ મેરીસ્ટેમ અને માપેલા મેરીસ્ટેમ વિસ્તારના કદની તપાસ કરી.25 μM KAND-11 ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓના મેરિસ્ટેમનું કદ 151.1 ± 32.5 μm હતું, જ્યારે DMSO ધરાવતા નિયંત્રણ માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓના મેરિસ્ટેમનું કદ 264.7 ± 30.8 μm (Figdm) , જે સૂચવે છે કે KAND-11 સેલ્યુલર પ્રવૃત્તિને પુનઃસ્થાપિત કરે છે.ફેલાવોરુટ મેરિસ્ટેમ.આની સાથે સુસંગત, KAND 11 સારવારથી રુટ મેરિસ્ટેમ (ફિગ. 4e) 17 માં સેલ ડિવિઝન માર્કર CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS સિગ્નલની માત્રામાં ઘટાડો થયો.આ પરિણામો સૂચવે છે કે KAND 11 કોષોના પ્રસારની પ્રવૃત્તિને ઘટાડીને મૂળના વિકાસને અટકાવે છે.
વૃદ્ધિ પર urbenonic એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝ (urbenyloxy ડેરિવેટિવ્ઝ) ની અવરોધક અસરનું વિશ્લેષણ.(a) KAND 11 ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા સાથે MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા 7-દિવસ જૂના જંગલી પ્રકારના કોલ રોપાઓ. સ્કેલ બાર = 1 સે.મી.(b) મૂળ લંબાઈનું પ્રમાણીકરણ.પત્રો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (તુકી એચએસડી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).n>16. ડેટા સરેરાશ ± SD તરીકે બતાવવામાં આવે છે.(c) 25 μM KAND 11 સાથે અથવા તેના વિના MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા પ્રોપીડિયમ આયોડાઇડ-સ્ટેઇન્ડ જંગલી પ્રકારના કોલ મૂળની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી. સફેદ કૌંસ મૂળ મેરિસ્ટેમ સૂચવે છે.સ્કેલ બાર = 100 µm.(d) રુટ મેરિસ્ટેમ કદનું પ્રમાણીકરણ (n = 10 થી 11).આંકડાકીય તફાવતો ટી-ટેસ્ટ (p< 0.05).બાર સરેરાશ મેરિસ્ટેમ કદનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.(e) વિભેદક હસ્તક્ષેપ કોન્ટ્રાસ્ટ (DIC) CDKB2 રચના ધરાવતી રુટ મેરિસ્ટેમની માઇક્રોસ્કોપી;1pro: CDKB2;25 µM KAND એસે સાથે અથવા વગર MS પ્લેટ પર ઉગાડવામાં આવેલા 5-દિવસ જૂના રોપાઓ પર 1-GUS સ્ટેઇન્ડ અને સ્ટેઇન્ડ.
KAND 11 ની ફાયટોટોક્સિસિટીનું વધુ પરીક્ષણ અન્ય ડાયકોટાઈલેડોનસ પ્લાન્ટ, તમાકુ (નિકોટીઆના ટેબેકમ), અને મુખ્ય જમીન છોડના મોડેલ જીવતંત્ર, લિવરવોર્ટ (માર્ચેન્ટિયા પોલીમોર્ફા) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.અરેબિડોપ્સિસના કિસ્સામાં, 25 μM કેન્ડ 11 ધરાવતા માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા તમાકુના SR-1 રોપાઓ ટૂંકા મૂળ (ફિગ. 5a) ઉત્પન્ન કરે છે.વધુમાં, 48 માંથી 40 બીજ 200 μM KAND 11 ધરાવતી પ્લેટ પર અંકુરિત થયા, જ્યારે તમામ 48 બીજ મોક ટ્રીટેડ માધ્યમો પર અંકુરિત થયા, જે દર્શાવે છે કે KAND ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા નોંધપાત્ર હતી (p< 0.05;chi test -square) તમાકુના અંકુરણને અટકાવે છે.(ફિગ. 5બી).વધુમાં, KAND 11 ની સાંદ્રતા જે લિવરવૉર્ટમાં બેક્ટેરિયાની વૃદ્ધિને અટકાવે છે તે અરેબિડોપ્સિસ (ફિગ. 5c) માં અસરકારક સાંદ્રતા જેવી જ હતી.આ પરિણામો દર્શાવે છે કે KAND 11 વિવિધ પ્રકારના છોડના વિકાસને રોકી શકે છે.ત્યારબાદ અમે અન્ય સજીવોમાં રીંછના મોનોઆમાઇડ-સંબંધિત સંયોજનોની સંભવિત સાયટોટોક્સિસિટીની તપાસ કરી, જેમ કે માનવ હેલા કોષો અને એસ્ચેરીચિયા કોલી સ્ટ્રેન DH5α, ઉચ્ચ પ્રાણી અને બેક્ટેરિયલ કોષોના પ્રતિનિધિઓ તરીકે, અનુક્રમે.કોષોના પ્રસારની શ્રેણીમાં, અમે અવલોકન કર્યું કે કુમામોનામાઇડ 1, કુમામોનામિડિક એસિડ 6 અને KAND 11 એ 100 μM (ફિગ. 5d,e) ની સાંદ્રતામાં HeLa અથવા E. કોલી કોશિકાઓના વિકાસને અસર કરી નથી.
બિન-અરેબીડોપ્સિસ સજીવોમાં KAND 11 ની વૃદ્ધિ અવરોધ.(a) બે સપ્તાહ જૂના જંગલી પ્રકારના SR-1 તમાકુના રોપાઓ ઊભી સ્થિતિમાં 25 μM KAND 11 ધરાવતી MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. (b) બે સપ્તાહ જૂના જંગલી પ્રકારના SR-1 તમાકુના રોપાઓ આડી સ્થિતિમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. 200 μM KAND 11 ધરાવતી MS પ્લેટ્સ. (c) GAMBOG B5 પ્લેટ્સ પર કેન્ડ 11 ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા સાથે ઉગાડવામાં આવેલી બે સપ્તાહ જૂની વાઇલ્ડ-ટાઇપ ટાક-1 લિવરવોર્ટ કળીઓ. લાલ તીર એવા બીજકણ સૂચવે છે જે બે અઠવાડિયાના સેવનમાં વધતા બંધ થઈ ગયા હતા. સમયગાળો(d) HeLa કોશિકાઓના કોષ પ્રસારની પરીક્ષા.સેલ કાઉન્ટિંગ કીટ 8 (ડોજિન્ડો) નો ઉપયોગ કરીને સધ્ધર કોષોની સંખ્યા નિશ્ચિત સમય અંતરાલ પર માપવામાં આવી હતી.નિયંત્રણ તરીકે, હેલા કોષોને 5 μg/ml એક્ટિનોમાસીન ડી (એક્ટ ડી) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જે આરએનએ પોલિમરેઝ ટ્રાન્સક્રિપ્શનને અટકાવે છે અને કોષોના મૃત્યુનું કારણ બને છે.વિશ્લેષણ ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવ્યું હતું.(e) ઇ. કોલી કોષ પ્રસાર પરી.ઇ. કોલી વૃદ્ધિનું OD600 માપવા દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.નિયંત્રણ તરીકે, કોષોને 50 μg/ml એમ્પીસિલિન (Amp) વડે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જે બેક્ટેરિયલ સેલ દિવાલ સંશ્લેષણને અટકાવે છે.વિશ્લેષણ ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવ્યું હતું.
યુરામાઇડ-સંબંધિત સંયોજનો દ્વારા થતી સાયટોટોક્સિસિટીની ક્રિયાની પદ્ધતિને સમજવા માટે, અમે મધ્યમ અવરોધક અસરો સાથે અર્બેનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝનું પુનઃવિશ્લેષણ કર્યું.જેમ કે તે ચિત્રમાં દર્શાવેલ છે.આકૃતિ 2b, 6a માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઉર્મોટોનિક એસિડ 6 ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા (200 μM) ધરાવતી અગર પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવતા રોપાઓ ટૂંકા અને ડાબા વળાંકવાળા મૂળ (θ = – 23.7 ± 6.1) ઉત્પન્ન કરે છે, જ્યારે નિયંત્રણ માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવેલા રોપાઓ, રોપાઓ લગભગ સીધા મૂળ ઉત્પન્ન કરે છે (θ = – 3.8 ± 7.1).આ લાક્ષણિકતા ત્રાંસી વૃદ્ધિ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ 14,18 ની નિષ્ક્રિયતાના પરિણામે જાણીતી છે.આ શોધ સાથે સુસંગત, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-અસ્થિર દવાઓ ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરીઝાલિન અમારી વૃદ્ધિની સ્થિતિમાં સમાન રુટ ટિલ્ટિંગને પ્રેરિત કરે છે (ફિગ. 2b, 6a).તે જ સમયે, અમે urmotonic એસિડ ડેરિવેટિવ્ઝનું પરીક્ષણ કર્યું અને તેમાંથી કેટલાકને પસંદ કર્યા કે જે ચોક્કસ સાંદ્રતામાં, ત્રાંસી મૂળ વૃદ્ધિને પ્રેરિત કરે છે.સંયોજનો 8, 9 અને 15 એ અનુક્રમે 75 μM, 50 μM અને 40 μM પર મૂળ વૃદ્ધિની દિશા બદલી છે, જે દર્શાવે છે કે આ સંયોજનો અસરકારક રીતે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસ્થિર કરી શકે છે (ફિગ. 2b, 6a).અમે સૌથી શક્તિશાળી ursolic એસિડ વ્યુત્પન્ન, KAND 11, ની ઓછી સાંદ્રતા (15 µM) પર પણ પરીક્ષણ કર્યું અને જાણવા મળ્યું કે KAND 11 ના ઉપયોગથી મૂળના વિકાસને અવરોધે છે અને મૂળ વૃદ્ધિની દિશા અસમાન હતી, જો કે તેઓ ડાબી તરફ ઢોળાવ કરતા હતા ( આકૃતિ C3)..કારણ કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-અસ્થિર દવાઓની ઉચ્ચ સાંદ્રતા કેટલીકવાર રુટ ટિલ્ટિંગને બદલે છોડના વિકાસને અટકાવે છે, અમે પછીથી એવી શક્યતાનું મૂલ્યાંકન કર્યું કે KAND 11 મૂળ એપિડર્મલ કોષોમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું નિરીક્ષણ કરીને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરે છે.25 μM KAND 11 સાથે સારવાર કરાયેલા બીજના મૂળના એપિડર્મલ કોશિકાઓમાં એન્ટિ-β-ટ્યુબ્યુલિન એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી એ વિસ્તરણ ઝોન (ફિગ. 6b) માં એપિડર્મલ કોશિકાઓમાં લગભગ તમામ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું અદ્રશ્ય હોવાનું દર્શાવ્યું હતું.આ પરિણામો સૂચવે છે કે કુમામોટોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્સ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર પ્રત્યક્ષ અથવા પરોક્ષ રીતે કાર્ય કરે છે અને તેમને વિક્ષેપિત કરે છે અને આ સંયોજનો નવલકથા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો છે.
ઉર્સોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ એરાબિડોપ્સિસ થલિયાનામાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને બદલે છે.(a) દર્શાવેલ સાંદ્રતા પર વિવિધ urmotonic acid ડેરિવેટિવ્સની હાજરીમાં માપવામાં આવેલ રુટ ઝોક કોણ.માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અટકાવવા માટે જાણીતા બે સંયોજનોની અસરો: ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરીઝાલિનનું પણ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ઇનસેટ રુટ વૃદ્ધિ કોણ માપવા માટે વપરાતું ધોરણ દર્શાવે છે.ફૂદડીઓ શેમ ટ્રીટમેન્ટ સાથે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે (ટી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).n>19. સ્કેલ બાર = 1 સે.મી.(b) વિસ્તરણ ઝોનમાં એપિડર્મલ કોશિકાઓમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ.25 μM KAND 11 સાથે અથવા તેના વિના MS પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવેલા જંગલી-પ્રકારના અરેબિડોપ્સિસ કોલ મૂળમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને β-ટ્યુબ્યુલિન પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ અને એલેક્સા ફ્લોર-કન્જુગેટેડ સેકન્ડરી એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગ દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.સ્કેલ બાર = 10 µm.(c) રુટ મેરીસ્ટેમમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું મિટોટિક માળખું.ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગનો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સની કલ્પના કરવામાં આવી હતી.પ્રોફેસ ઝોન, સ્પિન્ડલ્સ અને ફ્રેગ્મોપ્લાસ્ટ્સ સહિત મિટોટિક સ્ટ્રક્ચર્સની ગણતરી કોન્ફોકલ ઈમેજમાંથી કરવામાં આવી હતી.તીરો મિટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સ્ટ્રક્ચર્સ સૂચવે છે.ફૂદડીઓ શેમ ટ્રીટમેન્ટ સાથે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે (ટી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).n>9. સ્કેલ બાર = 50 µm.
જોકે ઉર્સામાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલના કાર્યને વિક્ષેપિત કરવાની ક્ષમતા છે, તેની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ લાક્ષણિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટોથી અલગ હોવાની અપેક્ષા છે.ઉદાહરણ તરીકે, ડીસોપાયરામાઇડ અને ઓરીઝાલિન જેવા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટોની ઊંચી સાંદ્રતા એપિડર્મલ કોશિકાઓના એનિસોટ્રોપિક વિસ્તરણને પ્રેરિત કરે છે, જ્યારે કેએન્ડ 11 એવું નથી.વધુમાં, KAND 11 અને disopyramide ના સહ-એપ્લિકેશનના પરિણામે સંયુક્ત ડિસોપાયરામાઇડ-પ્રેરિત મૂળ વૃદ્ધિ પ્રતિભાવ અને KAND 11-પ્રેરિત વૃદ્ધિ નિષેધ જોવા મળ્યો હતો (ફિગ. S4).અમે KAND 11 માટે અતિસંવેદનશીલ ડિસોપાયરમાઇડ 1-1 (phs1-1) મ્યુટન્ટના પ્રતિભાવનું પણ વિશ્લેષણ કર્યું છે. phs1-1 માં બિન-કેનોનિકલ ટ્યુબ્યુલિન કિનેઝ પોઈન્ટ મ્યુટેશન છે અને જ્યારે ડિસોપાયરમાઈડ 9,20 સાથે સારવાર કરવામાં આવે ત્યારે ટૂંકા મૂળ ઉત્પન્ન કરે છે.કેન્ડ 11 ધરાવતા અગર માધ્યમ પર ઉગાડવામાં આવતા phs1-1 મ્યુટન્ટ રોપાઓ ડિસોપાયરામિડ (અંજીર S5) પર ઉગાડવામાં આવતા મૂળ જેવા ટૂંકા મૂળ ધરાવે છે.
વધુમાં, અમે KAND 11 સાથે સારવાર કરાયેલા રોપાઓના રુટ મેરિસ્ટેમમાં પ્રોફેસ ઝોન, સ્પિન્ડલ્સ અને ફ્રેગ્મોપ્લાસ્ટ જેવા મિટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સ્ટ્રક્ચર્સનું અવલોકન કર્યું. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS માટેના અવલોકનો સાથે સુસંગત, નોંધપાત્ર ઘટાડો મિટોટિક માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સની સંખ્યા જોવા મળી હતી (ફિગ. .6c).
સબસેલ્યુલર રિઝોલ્યુશન પર KAND 11 ની સાયટોટોક્સિસિટી દર્શાવવા માટે, અમે KAND 11 સાથે તમાકુ BY-2 સસ્પેન્શન કોષોની સારવાર કરી અને તેમના પ્રતિભાવનું અવલોકન કર્યું.કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર KAND 11 ની અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે અમે સૌપ્રથમ KAND 11 ને BY-2 કોષોમાં ઉમેર્યું, જે TagRFP-TUA6 ને વ્યક્ત કરે છે, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને ફ્લોરોસન્ટલી લેબલ કરે છે.ઇમેજ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઘનતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું, જે સાયટોપ્લાઝમિક પિક્સેલ્સમાં સાયટોસ્કેલેટલ પિક્સેલ્સની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કરે છે.અભ્યાસના પરિણામો દર્શાવે છે કે 1 કલાક માટે 50 μM અથવા 100 μM KAND 11 સાથે સારવાર કર્યા પછી, ઘનતા નોંધપાત્ર રીતે ઘટીને અનુક્રમે 0.94 ± 0.74% અથવા 0.23 ± 0.28% થઈ ગઈ, જ્યારે DMSO સાથે સારવાર કરાયેલા કોષોની ઘનતા, 1.4±1 ± 6.4% થઈ. % (ફિગ. 7a).આ પરિણામો એરાબીડોપ્સિસમાંના અવલોકન સાથે સુસંગત છે કે KAND 11 સારવાર કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ (ફિગ. 6b) ના ડિપોલિમરાઇઝેશનને પ્રેરિત કરે છે.અમે KAND 11 ની સમાન સાંદ્રતા સાથે સારવાર કર્યા પછી GFP-ABD- લેબલવાળા એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ સાથે BY-2 લાઇનની પણ તપાસ કરી અને અવલોકન કર્યું કે KAND 11 ટ્રીટમેન્ટ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સમાં વિક્ષેપ પાડે છે.1 કલાક માટે 50 μM અથવા 100 μM KAND 11 સાથેની સારવારથી એક્ટિન ફિલામેન્ટની ઘનતામાં અનુક્રમે 1.20 ± 0.62% અથવા 0.61 ± 0.26% ઘટાડો થયો, જ્યારે DMSO-સારવાર કરાયેલ કોષોમાં ઘનતા 1.69 %F ± 0.5 ± 0.26% હતી.7b).આ પરિણામો પ્રોપાયઝામાઇડની અસરોથી વિપરીત છે, જે એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરતું નથી, અને લેટ્રનક્યુલિન બી, એક્ટિન ડિપોલિમરાઇઝર કે જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર કરતું નથી ( SI આકૃતિ S6).વધુમાં, કુમામોનામાઇડ 1, કુમામોનામાઇડ એસિડ 6, અથવા KAND 11 સાથેની સારવારથી HeLa કોશિકાઓમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને અસર થતી નથી (SI આકૃતિ S7).આમ, KAND 11 ની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ જાણીતા સાયટોસ્કેલેટન વિક્ષેપકો કરતાં અલગ હોવાનું માનવામાં આવે છે.વધુમાં, KAND 11 સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોના અમારા માઇક્રોસ્કોપિક અવલોકનથી KAND 11ની સારવાર દરમિયાન કોષ મૃત્યુની શરૂઆત થઈ અને તે દર્શાવે છે કે KAND 11ની સારવારના 30 મિનિટ પછી ઈવાન્સ વાદળી રંગના મૃત કોષોનું પ્રમાણ નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું નથી, જ્યારે 50 μM અથવા 100 μM KAND સાથે 90 મિનિટની સારવાર પછી, મૃત કોષોની સંખ્યા અનુક્રમે 43.7% અથવા 80.1% થઈ ગઈ (ફિગ. 7c).એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા સૂચવે છે કે નવલકથા ursolic acid ડેરિવેટિવ KAND 11 એ છોડ-વિશિષ્ટ સાયટોસ્કેલેટલ અવરોધક છે જેની ક્રિયાની અગાઉ અજાણી પદ્ધતિ છે.
KAND કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ, એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ અને તમાકુ BY-2 કોષોની કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે.(a) TagRFP-TUA6 ની હાજરીમાં BY-2 કોષોમાં કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સનું વિઝ્યુલાઇઝેશન.KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરવામાં આવી હતી.કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઘનતાની ગણતરી 25 સ્વતંત્ર કોષોના માઇક્રોગ્રાફ્સમાંથી કરવામાં આવી હતી.પત્રો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (તુકી એચએસડી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).સ્કેલ બાર = 10 µm.(b) BY-2 કોષોમાં કોર્ટિકલ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ GFP-ABD2 ની હાજરીમાં વિઝ્યુઅલાઈઝ થાય છે.KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરવામાં આવી હતી.કોર્ટિકલ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સની ઘનતા 25 સ્વતંત્ર કોષોના માઇક્રોગ્રાફ્સમાંથી ગણવામાં આવી હતી.પત્રો નોંધપાત્ર તફાવતો દર્શાવે છે (તુકી એચએસડી ટેસ્ટ, પૃષ્ઠ< 0.05).સ્કેલ બાર = 10 µm.(c) ઇવાન્સ બ્લુ સ્ટેનિંગ દ્વારા મૃત BY-2 કોષોનું અવલોકન.KAND 11 (50 μM અથવા 100 μM) અથવા DMSO સાથે સારવાર કરાયેલ BY-2 કોષોની તેજસ્વી-ક્ષેત્ર માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરવામાં આવી હતી.n=3.સ્કેલ બાર = 100 µm.
નવા કુદરતી ઉત્પાદનોની શોધ અને ઉપયોગથી દવા અને કૃષિ સહિત માનવ જીવનના વિવિધ પાસાઓમાં નોંધપાત્ર પ્રગતિ થઈ છે.કુદરતી સંસાધનોમાંથી ઉપયોગી સંયોજનો મેળવવા માટે ઐતિહાસિક સંશોધનો હાથ ધરવામાં આવ્યા છે.ખાસ કરીને, એક્ટિનોમાસીટ્સ નેમાટોડ્સ માટે એન્ટિપેરાસિટીક એન્ટિબાયોટિક્સ તરીકે ઉપયોગી તરીકે ઓળખાય છે કારણ કે એવરમેક્ટીન જેવા વિવિધ ગૌણ ચયાપચય પેદા કરવાની ક્ષમતાને કારણે, આઇવરમેક્ટીન અને બ્લોમાયસીનનું મુખ્ય સંયોજન અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ, જે ઔષધીય રીતે કેન્સર વિરોધી એજન્ટ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે 21,22.તેવી જ રીતે, એક્ટિનોમીસેટ્સમાંથી વિવિધ હર્બિસાઇડલ સંયોજનો શોધવામાં આવ્યા છે, જેમાંથી કેટલાક પહેલેથી જ 1,23 વ્યાપારી રીતે ઉપયોગમાં લેવાય છે.તેથી, ઇચ્છિત જૈવિક પ્રવૃત્તિઓ સાથે કુદરતી ઉત્પાદનોને અલગ કરવા માટે એક્ટિનોમીસેટ ચયાપચયનું વિશ્લેષણ અસરકારક વ્યૂહરચના માનવામાં આવે છે.આ અભ્યાસમાં, અમે S. werraensis માંથી એક નવું સંયોજન, coumamonamide શોધ્યું અને સફળતાપૂર્વક તેનું સંશ્લેષણ કર્યું.અર્સોનિક એસિડ એ urbenamide અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝનું કૃત્રિમ મધ્યવર્તી છે.તે લાક્ષણિક રુટ કર્લિંગનું કારણ બની શકે છે, મધ્યમથી મજબૂત હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિ દર્શાવે છે અને છોડના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને પ્રત્યક્ષ કે પરોક્ષ રીતે નુકસાન પહોંચાડે છે.જો કે, યુરમોટોનિક એસિડની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ હાલના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અવરોધકો કરતાં અલગ હોઈ શકે છે, કારણ કે KAND 11 એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને પણ વિક્ષેપિત કરે છે અને કોષ મૃત્યુનું કારણ બને છે, જે એક નિયમનકારી પદ્ધતિ સૂચવે છે જેના દ્વારા urmotonic એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્સ સાયટોસ્કેલેટલ સ્ટ્રક્ચર્સની વિશાળ શ્રેણીને પ્રભાવિત કરે છે..
urbenonic acid ની વધુ વિગતવાર લાક્ષણિકતા urbenonic acid ની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિને વધુ સારી રીતે સમજવામાં મદદ કરશે.ખાસ કરીને, આગામી ધ્યેય એ નિર્ધારિત કરવા માટે કે શું યુર્સોનિક એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્સ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ પર સીધા જ કાર્ય કરે છે અને તેમને ડિપોલિમરાઇઝ કરે છે, અથવા શું તેમની ક્રિયા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ અસ્થિરતામાં પરિણમે છે તે નિર્ધારિત કરવા માટે ઘટાડેલા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સાથે જોડવાની અર્સોનિક એસિડની ક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવાનો છે.વધુમાં, એવા કિસ્સામાં કે જ્યાં સૂક્ષ્મ ટ્યુબ્યુલ્સ સીધું લક્ષ્ય નથી, છોડના કોષો પરની ક્રિયાના સ્થળ અને અર્સોનિક એસિડના પરમાણુ લક્ષ્યોને ઓળખવાથી સંબંધિત સંયોજનોના ગુણધર્મો અને હર્બિસાઇડલ પ્રવૃત્તિને સુધારવાની સંભવિત રીતોને વધુ સમજવામાં મદદ મળશે.અમારી બાયોએક્ટિવિટી એસે એરેબિડોપ્સિસ થલિયાના, તમાકુ અને લિવરવોર્ટ જેવા છોડની વૃદ્ધિ પર યુર્સોનિક એસિડની અનન્ય સાયટોટોક્સિક ક્ષમતા જાહેર કરી, જ્યારે ઇ. કોલી કે હેલા કોષો પર અસર થઈ ન હતી.પ્રાણીઓના કોષો માટે ઓછી અથવા ઓછી ઝેરીતા એ યુર્સોનિક એસિડ ડેરિવેટિવ્સનો ફાયદો છે જો તેઓ ખુલ્લા કૃષિ ક્ષેત્રોમાં ઉપયોગ માટે હર્બિસાઇડ્સ તરીકે વિકસાવવામાં આવે છે.ખરેખર, યુકેરીયોટ્સમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ સામાન્ય માળખું હોવાથી, છોડમાં તેમનો પસંદગીયુક્ત અવરોધ હર્બિસાઇડ્સ માટેની મુખ્ય જરૂરિયાત છે.ઉદાહરણ તરીકે, પ્રોપાયઝામાઇડ, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડિપોલિમરાઇઝિંગ એજન્ટ કે જે ટ્યુબ્યુલિન સાથે સીધું જ જોડાય છે અને પોલિમરાઇઝેશનને અટકાવે છે, તેનો ઉપયોગ હર્બિસાઇડ તરીકે થાય છે કારણ કે તેની પ્રાણી કોષો માટે ઓછી ઝેરી છે24.ડિસોપાયરામાઇડથી વિપરીત, સંબંધિત બેન્ઝામાઇડ્સ વિવિધ લક્ષ્ય વિશિષ્ટતાઓ ધરાવે છે.વનસ્પતિ સૂક્ષ્મ ટ્યુબ્યુલ્સ ઉપરાંત, RH-4032 અથવા બેન્ઝોક્સામાઇડ અનુક્રમે પ્રાણી કોષો અથવા oomycetes ના માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને પણ અટકાવે છે, અને તેની ઓછી ફાયટોટોક્સિસિટી 25,26,27ને કારણે ઝાલીલામાઇડનો ઉપયોગ ફૂગનાશક તરીકે થાય છે.નવા શોધાયેલ રીંછ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ છોડ સામે પસંદગીયુક્ત સાયટોટોક્સિસીટી દર્શાવે છે, પરંતુ તે નોંધવું યોગ્ય છે કે વધુ ફેરફારો તેમના લક્ષ્ય વિશિષ્ટતાને બદલી શકે છે, સંભવિત રીતે રોગકારક ફૂગ અથવા oomycetes ના નિયંત્રણ માટે વધારાના ડેરિવેટિવ્સ પ્રદાન કરે છે.
urbenonic એસિડ અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝના અનન્ય ગુણધર્મો હર્બિસાઇડ્સ તરીકે તેમના વિકાસ માટે અને સંશોધન સાધનો તરીકે ઉપયોગ કરવા માટે ઉપયોગી છે.છોડના કોષના આકારને નિયંત્રિત કરવામાં સાયટોસ્કેલેટનનું મહત્વ વ્યાપકપણે ઓળખાય છે.અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે વનસ્પતિઓએ મોર્ફોજેનેસિસને યોગ્ય રીતે નિયંત્રિત કરવા માટે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરીને કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સંસ્થાની જટિલ પદ્ધતિઓ વિકસાવી છે.માઇક્રોટ્યુબ્યુલ પ્રવૃત્તિના નિયમન માટે જવાબદાર મોટી સંખ્યામાં પરમાણુઓની ઓળખ કરવામાં આવી છે, અને સંબંધિત સંશોધન હજુ પણ ચાલુ છે3,4,28.છોડના કોષોમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડાયનેમિક્સની અમારી વર્તમાન સમજ કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સંસ્થાની પદ્ધતિઓને સંપૂર્ણ રીતે સમજાવતી નથી.ઉદાહરણ તરીકે, જોકે ડિસોપાયરામાઇડ અને ઓરીઝાલિન બંને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને ડિપોલિમરાઇઝ કરી શકે છે, ડિસોપાયરામાઇડ ગંભીર મૂળ વિકૃતિનું કારણ બને છે જ્યારે ઓરીઝાલિન પ્રમાણમાં હળવી અસર ધરાવે છે.તદુપરાંત, ટ્યુબ્યુલિનમાં પરિવર્તન, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સને સ્થિર કરે છે, તે પણ મૂળમાં ડેક્સ્ટ્રોરોટેશનનું કારણ બને છે, જ્યારે પેક્લિટાક્સેલ, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ગતિશીલતાને પણ સ્થિર કરે છે, તે થતું નથી.તેથી, ursolic એસિડના પરમાણુ લક્ષ્યોનો અભ્યાસ અને ઓળખ કરવાથી છોડના કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સના નિયમનમાં નવી આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરવી જોઈએ.તેવી જ રીતે, વિકૃત વૃદ્ધિને પ્રોત્સાહન આપવા માટે અસરકારક એવા રસાયણોની ભાવિ સરખામણીઓ, જેમ કે ડિસોપાયરામાઇડ, અને ઓછા અસરકારક રસાયણો, જેમ કે ઓરીઝાલિન અથવા કુમામોટોરિક એસિડ, વિકૃત વૃદ્ધિ કેવી રીતે થાય છે તેના સંકેતો પ્રદાન કરશે.
બીજી બાજુ, સંરક્ષણ-સંબંધિત સાયટોસ્કેલેટલ પુન: ગોઠવણી એ યુર્સોનિક એસિડની સાયટોટોક્સિસિટી સમજાવવાની બીજી શક્યતા છે.પેથોજેનનો ચેપ અથવા છોડના કોષોમાં એલિસીટરનો પ્રવેશ ક્યારેક સાયટોસ્કેલેટનનો વિનાશ અને ત્યારબાદ કોષ મૃત્યુનું કારણ બને છે.ઉદાહરણ તરીકે, તમાકુના કોષના મૃત્યુ પહેલા oomycete-ઉત્પન્ન ક્રિપ્ટોક્સાન્થિન માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને વિક્ષેપિત કરે છે, જે KAND સારવાર 30,31 સાથે થાય છે તેના જેવું જ છે.યુર્સોનિક એસિડ દ્વારા પ્રેરિત સંરક્ષણ પ્રતિભાવો અને સેલ્યુલર પ્રતિભાવો વચ્ચેની સમાનતાએ અમને એવી ધારણા કરવા તરફ દોરી કે તેઓ સામાન્ય સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓને ટ્રિગર કરે છે, જો કે ક્રિપ્ટોક્સેન્થિન કરતાં યુર્સોનિક એસિડની ઝડપી અને મજબૂત અસર સ્પષ્ટ છે.જો કે, અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સનું વિક્ષેપ સ્વયંસ્ફુરિત કોષ મૃત્યુને પ્રોત્સાહન આપે છે, જે હંમેશા માઇક્રોટ્યુબ્યુલ વિક્ષેપ સાથે નથી29.વધુમાં, તે જોવાનું બાકી છે કે શું પેથોજેન અથવા એલિસીટર વિકૃત મૂળ વૃદ્ધિનું કારણ બને છે, જેમ કે ursonic acid ડેરિવેટિવ્ઝ કરે છે.આમ, સંરક્ષણ પ્રતિભાવો અને સાયટોસ્કેલેટનને જોડતું મોલેક્યુલર જ્ઞાન એ સંબોધવા માટેની આકર્ષક સમસ્યા છે.ursonic એસિડ સંબંધિત નીચા પરમાણુ વજન સંયોજનોની હાજરીનું શોષણ કરીને, તેમજ વિવિધ ક્ષમતાઓ સાથે ડેરિવેટિવ્સની શ્રેણી, તેઓ અજાણ્યા સેલ્યુલર મિકેનિઝમ્સને લક્ષ્ય બનાવવાની તકો પૂરી પાડી શકે છે.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ડાયનેમિક્સને મોડ્યુલેટ કરતા નવા સંયોજનોની શોધ અને એપ્લિકેશન છોડના કોષના આકારના નિર્ધારણ હેઠળના જટિલ મોલેક્યુલર મિકેનિઝમ્સને સંબોધવા માટે શક્તિશાળી પદ્ધતિઓ પ્રદાન કરશે.આ સંદર્ભમાં, તાજેતરમાં વિકસિત સંયોજન યુરમોટોનિક એસિડ, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સને અસર કરે છે અને કોષ મૃત્યુને પ્રેરિત કરે છે, તે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ નિયંત્રણ અને આ અન્ય પદ્ધતિઓ વચ્ચેના જોડાણને સમજવાની તક પૂરી પાડી શકે છે.આમ, urbenonic એસિડનો ઉપયોગ કરીને રાસાયણિક અને જૈવિક વિશ્લેષણ આપણને છોડના સાયટોસ્કેલેટનને નિયંત્રિત કરતી પરમાણુ નિયમનકારી પદ્ધતિઓ સમજવામાં મદદ કરશે.
S. werraensis MK493-CF1 ને 500 એમએલના બેફલ્ડ એર્લેનમેયર ફ્લાસ્કમાં ઇનોક્યુલેટ કરો જેમાં 110 એમએલ બીજ માધ્યમ હોય છે જેમાં 2% (w/v) ગેલેક્ટોઝ, 2% (w/v) એસેન્સ પેસ્ટ, 1% ( w/v) બેક્ટો કમ્પોઝિશન હોય છે. .-સોયટોન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, Inc.), 0.5% (w/v) મકાઈનો અર્ક (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 અને 0.2% CaCO3 ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં.(વંધ્યીકરણ પહેલાં pH 7.4).બીજ સંસ્કૃતિઓને રોટરી શેકર (180 rpm) પર 27 ° સે તાપમાને 2 દિવસ માટે ઉકાળવામાં આવી હતી.ઘન રાજ્ય આથો દ્વારા ઉત્પાદન ખેતી.બીજ સંવર્ધન (7 મિલી) 500 મિલી K-1 ફ્લાસ્કમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 15 ગ્રામ પ્રેસ્ડ જવ (MUSO Co., Ltd., Japan) અને 25 ગ્રામ ડિયોનાઇઝ્ડ વોટર (pH એડજસ્ટ કરવામાં આવ્યું નથી) 40 ગ્રામ ઉત્પાદન માધ્યમ ધરાવે છે. વંધ્યીકરણ પહેલાં).).આથો 14 દિવસ માટે અંધારામાં 30 ° સે પર હાથ ધરવામાં આવ્યો હતો.આથોની સામગ્રી 40 મિલી/બોટલ EtOH અને સેન્ટ્રીફ્યુજ (1500 ગ્રામ, 4°C, 10 મિનિટ) વડે કાઢવામાં આવી હતી.કલ્ચર સુપરનેટન્ટ (60 મિલી) 10% MeOH/EtOAc ના મિશ્રણ સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું.અવશેષ (59.5 મિલિગ્રામ) મેળવવા માટે ઓછા દબાણ હેઠળ ઓર્ગેનિક સ્તરનું બાષ્પીભવન કરવામાં આવ્યું હતું, જે રિવર્સ ફેઝ કોલમ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) પર ગ્રેડિયન્ટ ઇલ્યુશન (0-10 મિનિટ: 90%) સાથે HPLCને આધિન હતું. 10 mm × લંબાઈ 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 મિનિટ: 90% H2O/CH3CN થી 70% H2O/CH3CN (ગ્રેડિયન્ટ), 35-45 મિનિટ: 90% H2O/EtOH, 45–155 મિનિટ: 90% HO2 /EtOH થી 100% EtOH (ગ્રેડિયન્ટ (ગ્રેડિયન્ટ), 155-200 મિનિટ: 100% EtOH) 1.5 મિલી/મિનિટના પ્રવાહ દરે, કુમામોનામાઇડ (1, 36.0 મિલિગ્રામ) સફેદ આકારહીન પાવડર તરીકે અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.
કુમામોટોમાઇડ (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ગણતરી કરેલ મૂલ્ય: 141.0659, માપેલ મૂલ્ય: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1573, 157cm.
કોલંબિયાના બીજ (કોલ-0) એરેબીડોપ્સિસ બાયોલોજિકલ રિસોર્સ સેન્ટર (એબીઆરસી) પાસેથી સંશોધન ઉપયોગ માટે પરવાનગી સાથે મેળવવામાં આવ્યા હતા.Col-0 બીજનો પ્રચાર અને જાળવણી અમારી પ્રયોગશાળાની પરિસ્થિતિઓમાં કરવામાં આવી હતી અને તેનો ઉપયોગ જંગલી પ્રકારના અરેબિડોપ્સિસ છોડ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.અરેબીડોપ્સિસના બીજને અર્ધ-શક્તિવાળા મુરાશિગ અને સ્કૂગ માધ્યમમાં વંધ્યીકૃત અને સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં 2% સુક્રોઝ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ), 0.05% (ડબલ્યુ/વી) 2-(4-મોર્ફોલિનો) ઇથેનેસલ્ફોનિક એસિડ (એમઈએસ) ( ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યુર કેમિકલ) ).) અને 1.5% અગર (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ), pH 5.7, 23 °C પર અને સતત પ્રકાશ.phs1-1 મ્યુટન્ટના બીજ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા.
તાણ SR-1 ના બીજ ટી. હાશિમોટો (નારા ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ સાયન્સ એન્ડ ટેક્નોલોજી) દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા અને તેનો જંગલી પ્રકારના તમાકુના છોડ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.તમાકુના બીજને સપાટીથી જંતુરહિત કરવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરણને પ્રોત્સાહન આપવા માટે ત્રણ રાત સુધી જંતુરહિત પાણીમાં પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા, પછી 2% સુક્રોઝ, 0.05% (w/v) MES અને 0.8% ગેલન ગમ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) ધરાવતા અડધા-શક્તિવાળા દ્રાવણમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા. મુરાશિગે.અને સ્કૂગ માધ્યમ) pH 5.7 સાથે અને સતત પ્રકાશમાં 23°C પર ઉકાળવામાં આવે છે.
T. Kohchi (ક્યોટો યુનિવર્સિટી) દ્વારા સ્ટ્રેન ટાક-1 પ્રદાન કરવામાં આવ્યું હતું અને તેનો ઉપયોગ લિવરવોર્ટ અભ્યાસ માટે પ્રમાણભૂત પ્રાયોગિક એકમ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.જેમ્માને વંધ્યીકૃત સંવર્ધિત છોડમાંથી મેળવવામાં આવ્યો હતો અને પછી 1% સુક્રોઝ અને 0.3% ગેલન ગમ ધરાવતા ગેમ્બોર્ગ B5 માધ્યમ (ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) પર પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યો હતો અને સતત પ્રકાશમાં 23 ° સે તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યો હતો.
તમાકુ BY-2 કોષો (Nicotiana tabacum L. cv. બ્રાઇટ યલો 2) S. Hasezawa (ટોક્યો યુનિવર્સિટી) દ્વારા પ્રદાન કરવામાં આવ્યા હતા.BY-2 કોષોને સંશોધિત લિન્સમીયર અને સ્કૂગ માધ્યમમાં 95-ગણા પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને 2,4-ડીક્લોરોફેનોક્સ્યાસેટિક એસિડ 32 સાથે સાપ્તાહિક પૂરક કરવામાં આવ્યું હતું.સેલ સસ્પેન્શનને અંધારામાં 27°C પર 130 rpm પર રોટરી શેકર પર મિશ્ર કરવામાં આવ્યું હતું.તાજા માધ્યમના 10 ગણા વોલ્યુમ સાથે કોષોને ધોઈ લો અને તે જ માધ્યમમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો.કોલીફ્લાવર મોઝેક વાયરસ 35S પ્રમોટર હેઠળ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ માર્કર TagRFP-TUA6 અથવા એક્ટિન ફિલામેન્ટ માર્કર GFP-ABD2 ને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરતી BY-2 ટ્રાન્સજેનિક સેલ લાઇન્સ 33,34,35 વર્ણવ્યા પ્રમાણે બનાવવામાં આવી હતી.મૂળ BY-2 સેલ લાઇન માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પ્રક્રિયાઓ જેવી જ પ્રક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરીને આ કોષ રેખાઓને જાળવી અને સુમેળ કરી શકાય છે.
હેલા કોષોને ડુલ્બેકોના સંશોધિત ઇગલના માધ્યમ (DMEM) (લાઇફ ટેક્નોલોજી)માં 10% ગર્ભ બોવાઇન સીરમ, 1.2 U/ml પેનિસિલિન અને 1.2 μg/ml સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન સાથે 37°C %2 સાથે ઇન્ક્યુબેટરમાં સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા.
આ હસ્તપ્રતમાં વર્ણવેલ તમામ પ્રયોગો જાપાની જૈવ સુરક્ષા નિયમો અને માર્ગદર્શિકા અનુસાર કરવામાં આવ્યા હતા.
સ્ટોક સોલ્યુશન્સ તરીકે ડાયમિથાઈલ સલ્ફોક્સાઈડ (DMSO; ફુજીફિલ્મ વાકો પ્યોર કેમિકલ) માં સંયોજનો ઓગળવામાં આવ્યા હતા અને એરાબીડોપ્સિસ માટે MS માધ્યમમાં અને લિવરવોર્ટ માટે તમાકુ અથવા ગેમ્બોર્ગ B5 માધ્યમમાં ઓગળવામાં આવ્યા હતા.મૂળ વૃદ્ધિ નિષેધ પરીક્ષા માટે, પ્લેટ દીઠ 10 થી વધુ બીજ અગર માધ્યમ પર વાવવામાં આવ્યા હતા જેમાં સૂચિત સંયોજનો અથવા DMSO હતા.બીજને ગ્રોથ ચેમ્બરમાં 7 દિવસ માટે ઉકાળવામાં આવે છે.રોપાઓનો ફોટોગ્રાફ લેવામાં આવ્યો હતો અને મૂળની લંબાઈ માપવામાં આવી હતી.અરેબીડોપ્સિસ અંકુરણ પરીક્ષા માટે, 200 μM સંયોજન અથવા DMSO ધરાવતા અગર માધ્યમ પર પ્લેટ દીઠ 48 બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા.અરેબીડોપ્સિસના બીજને ગ્રોથ ચેમ્બરમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરણ (ડેગ) પછી 7 દિવસ પછી અંકુરિત રોપાઓની સંખ્યા ગણવામાં આવી હતી.તમાકુના અંકુરણ પરીક્ષા માટે, પ્લેટ દીઠ 24 બીજ અગર માધ્યમ પર વાવવામાં આવ્યા હતા જેમાં 200 μM KAND અથવા DMSO હોય છે.તમાકુના બીજ ગ્રોથ ચેમ્બરમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને અંકુરિત રોપાઓની સંખ્યા 14 દિવસ પછી ગણવામાં આવી હતી.લિવરવૉર્ટ વૃદ્ધિ નિષેધ પરીક્ષા માટે, દરેક પ્લેટમાંથી 9 ભ્રૂણને અગર માધ્યમ પર પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં KAND અથવા DMSO ની દર્શાવેલ સાંદ્રતા હતી અને 14 દિવસ માટે વૃદ્ધિ ચેમ્બરમાં ઉકાળવામાં આવી હતી.
રુટ મેરિસ્ટેમ ઓર્ગેનાઈઝેશનની કલ્પના કરવા માટે 5 મિલિગ્રામ/એમએલ પ્રોપિડિયમ આયોડાઈડ (PI) સાથે ડાઘવાળા રોપાઓનો ઉપયોગ કરો.TCS SPE કોન્ફોકલ લેસર સ્કેનિંગ માઈક્રોસ્કોપ (Leica Microsystems) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ માઈક્રોસ્કોપી દ્વારા PI સિગ્નલો જોવામાં આવ્યા હતા.
β-glucuronidase (GUS) સાથેના મૂળના હિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગને માલમી અને બેનફે 36 દ્વારા વર્ણવેલ પ્રોટોકોલ અનુસાર કરવામાં આવ્યું હતું.રોપાઓ રાતોરાત 90% એસીટોનમાં ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા, 0.5 મિલિગ્રામ/એમએલ 5-બ્રોમો-4-ક્લોરો-3-ઇન્ડોલિલ-બીટા-ડી-ગ્લુકોરોનિક એસિડથી 1 કલાક માટે GUS બફરમાં સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા અને હાઇડ્રેટેડ ક્લોરાલ્ડિહાઇડ સોલ્યુશનમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા.(8 ગ્રામ ક્લોરલ હાઇડ્રેટ, 2 મિલી પાણી અને 1 મિલી ગ્લિસરોલ) અને એક્સિયો ઈમેજર M1 માઈક્રોસ્કોપ (કાર્લ ઝીસ) નો ઉપયોગ કરીને વિભેદક હસ્તક્ષેપ કોન્ટ્રાસ્ટ માઈક્રોસ્કોપી દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવે છે.
રુટ એંગલ્સ 7-દિવસ જૂના રોપાઓ પર માપવામાં આવ્યા હતા જે ઊભી રીતે મૂકવામાં આવેલી પ્લેટો પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા.સ્ટેપ 6 માં વર્ણવ્યા મુજબ ગુરુત્વાકર્ષણ વેક્ટરની દિશામાંથી મૂળના કોણને માપો.
પ્રોટોકોલ 37 માં નાના ફેરફારો સાથે, કોર્ટિકલ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સની ગોઠવણી વર્ણવ્યા પ્રમાણે જોવા મળી હતી.એન્ટિ-બીટા-ટ્યુબ્યુલિન એન્ટિબોડી (KMX-1, મર્ક મિલિપોર: MAB3408) અને એલેક્સા ફ્લોર 488-સંયોજિત એન્ટિ-માઉસ IgG (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક: A32723) નો ઉપયોગ 1:1000 અને 1:100 પર પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, અનુક્રમેTCS SPE કોન્ફોકલ લેસર સ્કેનિંગ માઈક્રોસ્કોપ (Leica Microsystems) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ ઈમેજો હસ્તગત કરવામાં આવી હતી.Z-સ્ટેક ઈમેજીસ મેળવો અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર મહત્તમ તીવ્રતાના અંદાજો બનાવો.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર સેલ કાઉન્ટિંગ કિટ 8 (ડોજિન્ડો) નો ઉપયોગ કરીને હેલા સેલ પ્રસારની તપાસ કરવામાં આવી હતી.
E. coli DH5α ની વૃદ્ધિ 600 nm (OD600) પર સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને સંસ્કૃતિમાં કોષની ઘનતાને માપીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
ટ્રાન્સજેનિક BY-2 કોષોમાં સાયટોસ્કેલેટલ સંસ્થા CSU-X1 કોન્ફોકલ સ્કેનિંગ ઉપકરણ (યોકોગાવા) અને sCMOS કૅમેરા (Zyla, Andor Technology) થી સજ્જ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને જોવામાં આવી હતી.સાયટોસ્કેલેટલ ઘનતાનું મૂલ્યાંકન ઇમેજ વિશ્લેષણ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું, જેણે 38,39 તરીકે વર્ણવ્યા પ્રમાણે ઇમેજજે સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કોન્ફોકલ ઇમેજમાં સાયટોપ્લાઝમિક પિક્સેલ્સમાં સાયટોસ્કેલેટલ પિક્સેલ્સની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું હતું.
BY-2 કોષોમાં કોષ મૃત્યુ શોધવા માટે, ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે 0.05% ઇવાન્સ બ્લુ સાથે કોષ સસ્પેન્શનના અલિકોટને ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.મૃત કોષોનું પસંદગીયુક્ત ઇવાન્સ બ્લુ સ્ટેનિંગ અખંડ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન40 દ્વારા સધ્ધર કોષોમાંથી રંગને બહાર કાઢવા પર આધાર રાખે છે.બ્રાઇટ-ફીલ્ડ માઇક્રોસ્કોપ (BX53, ઓલિમ્પસ) નો ઉપયોગ કરીને સ્ટેઇન્ડ કોશિકાઓ જોવામાં આવી હતી.
HeLa કોષો DMEM માં 10% FBS સાથે 37°C અને 5% CO2 પર ભેજયુક્ત ઇન્ક્યુબેટરમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા.કોષોને 100 μM KAND 11, કુમામોનામિક એસિડ 6, કુમામોનામાઇડ 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), અથવા 100 ng/ml નોકોડમેઝ (સિગ્મા) સાથે 37 ° સે તાપમાને 6 કલાક માટે સારવાર આપવામાં આવી હતી.કોષોને મેટઓએચ સાથે 10 મિનિટ માટે અને પછી ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે એસિટેટ સાથે નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા.સ્થિર કોષોને β-ટ્યુબ્યુલિન પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (1D4A4, પ્રોટીનટેક: 66240-1) 0.5% BSA/PBS માં 2 કલાક માટે ભેળવવામાં આવ્યા હતા, TBST વડે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પછી એલેક્સા ફ્લોર બકરી એન્ટિબોડી સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.488 1 કલાક.- માઉસ IgG (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક: A11001) અને 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS માં પાતળું.TBST સાથે ત્રણ વખત ધોવા પછી, નિકોન એક્લિપ્સ Ti-E ઇન્વર્ટેડ માઇક્રોસ્કોપ પર ડાઘવાળા કોષો જોવા મળ્યા હતા.મેટામોર્ફ સોફ્ટવેર (મોલેક્યુલર ડિવાઈસીસ)નો ઉપયોગ કરીને કૂલ્ડ હમામાત્સુ ORCA-R2 CCD કેમેરા વડે ઈમેજો કેપ્ચર કરવામાં આવી હતી.